Injeksi Spermatozoa Domba Hasil Pengeringbekuan

February 3, 2010

Injeksi Spermatozoa Domba Hasil Pengeringbekuan  ke dalam Oosit Menggunakan Teknik Intracytoplasmic Sperm Injection (ICSI)

 (INJECTION OF FREEZE-DRIED RAM SPERMATOZOA INTO OOCYTES USING INTRACYTOPLASMIC SPERM INJECTION, ICSI)  

 TAKDIR SAILI1, MOHAMAD AGUS SETIADI2, SRIHADI AGUNGPRIYONO3, ARIEF BOEDIONO3

1Jurusan Produksi Ternak, Fakultas Pertanian, Universitas Haluoleo, Kendari 93232 

2 Departemen Klinik, Reproduksi dan Patologi FKH-IPB. Kampus Darmaga, Bogor 16680 

3 Departemen Anatomi, Fisiologi dan Farmakologi FKH-IPB. Kampus Darmaga, Bogor 16680 

 ABSTRAK

Pada penelitian ini dikaji kemampuan spermatozoa domba hasil pengeringbekuan untuk melakukan dekondensasi dan membentuk pronukleus setelah diinjeksikan ke dalam oosit dengan menggunakan teknik intracytoplasmic sperm injection (ICSI). Metode pewarnaan aceto lacmoid digunakan untuk mengevaluasi kejadian dekondensasi dan pembentukan pronukleus pada oosit setelah ICSI. Hasil penelitian menunjukkan bahwa spermatozoa hasil pengeringbekuan dapat melakukan dekondensasi (2%) dan mendukung pembentukan satu ponukleus (1PN) (34%) tetapi belum mampu mendukung pembentukan dua pronukleus (2PN) setelah diinjeksikan ke dalam oosit. Sedangkan injeksi dengan menggunakan spermatozoa segar mampu mendukung pembentukan 2PN (30%) dan 1PN (40%). Sebagai kesimpulan dapat dikemukakan bahwa spermatozoa hasil pengeringbekuan mampu melakukan dekondensasi dan mendukung pembetukan 1PN setelah ICSI.

Kata kunci: spermatozoa, pengeringbekuan, oosit, ICSI, dekondensasi, pronukleus

ABSTRACT

In this experiment, the ability of freeze-dried ram spermatozoa to decondense and to support pronucleus formation after injection into oocyte using ICSI method was evaluated. Aceto lacmoid staining was used to assess decondensation and pronucleus formation following ICSI. Results of these experiments revealed that freeze-dried spermatozoa had the ability to decondense (2%) and to induce 1PN formation (34%) following injection into oocytes but fail to form 2PN. However, 30% of 2PN and 40% of 1PN were obtained when oocytes were injected with fresh spermatozoa.  In conclusion, freeze-dried ram spermatozoa were able to decondense and to support 1PN formation after ICSI.

Key words:  spermatozoa, freeze-dried, oocyte, ICSI, decondensation, pronucleus.

 PENDAHULUAN

            Pengeringbekuan merupakan salah satu metode pengawetan spermatozoa melalui proses pembekuan dan penyubliman yang pada akhirnya akan dihasilkan sediaan spermatozoa dalam kemasan kering. Selama masa penyimpanan, kemasan spermatozoa hasil pengeringbekuan dapat ditempatkan pada lemari es (3-5 oC) atau suhu ruang sehingga tidak membutuhkan suplai nitrogen cair yang terus-menerus seperti penyimpanan spermatozoa dalam kemasan beku. Hal ini akan mempermudah pendistribusiannya dari satu tempat ke tempat lain. Namun demikian pemanfaatan spermatozoa hasil pengeringbekuan untuk tujuan fertilisasi oosit hanya dapat dilakukan melalui teknik intracytoplasmic sperm injection (ICSI) karena tidak bersifat motil lagi dan telah mengalami kerusakan struktur membran plasma dan akrosom (Saili et al. 2006).  ICSI adalah suatu metode fertilisasi mikro menggunakan mikromanipulator yang terpasang pada mikroskop. Melalui teknik ICSI kita dapat memasukkan secara langsung spermatozoon ke dalam sitoplasma oosit sehingga beberapa hambatan dalam fertilisasi normal dapat terabaikan.

            Beberapa percobaan fertilisasi melalui teknik ICSI membuktikan bahwa oosit yang dibuahi oleh spermatozoa hasil pengeringbekuan mampu membentuk pronukleus pada hamster (Hoshi et al. 1994) atau berkembang menjadi embrio pada sapi (Keskintepe et al. 2001) bahkan dapat berkembang menjadi anak mencit yang normal setelah ditransfer ke resipien (Wakayama dan Yanagimachi 1998). Hal ini dapat terjadi karena integritas DNA spermatozoa diperkirakan masih utuh sehingga mampu mendukung proses fertilisasi dengan baik.

Daya tahan inti spermatozoa terhadap suhu rendah telah dibuktikan dengan lahirnya beberapa anak hasil inseminasi dengan menggunakan spermatozoa beku (Watson 1990).  Selain itu, DNA spermatozoa mempunyai pelindung yang dapat mengamankannya dari pengaruh fisik dan kimia. Spermatozoa juga tahan terhadap suhu panas, bahkan spermatozoa hamster yang dipapar pada suhu 90 oC selama 30 menit pun masih mampu membentuk pronukleus (Yanagida et al. 1991). Daya tahan inti spermatozoa terhadap proses pengeringan telah dibuktikan pula melalui pengeringbekuan spermatozoa manusia yang dilanjutkan dengan penyimpanan di dalam desikator selama beberapa bulan masih mampu mendukung pembentukan pronukleus (Katayose et al. 1992).

Penelitian yang ditujukan untuk menguji kemampuan spematozoa hasil pengeringbekuan dalam mendukung proses fertilisasi oosit melalui teknik ICSI, masih terbatas pada hewan percobaan seperti  kelinci (Liu et al. 2004), tikus (Said 2003), mencit (Wakayama dan Yanagimachi 1998) dan hamster (Hoshi et al. 1994).  Penelitian serupa juga sudah dilakukan pada manusia (Katayose et al. 1992) dan hewan ternak seperti babi (Kwon et al. 2004) dan sapi (Keskintepe et al. 2001). Oleh karena itu perlu dilakukan penelitian dengan menggunakan hewan uji yang lain seperti domba untuk mengetahui apakah keberhasilan penerapan metode ini pada hewan percobaan juga dapat diperoleh pada hewan ternak domba.

 BAHAN DAN METODE

Pengambilan dan Penyiapan Spermatozoa

Semen diperoleh dari seekor pejantan domba yang dikoleksi dengan menggunakan vagina buatan. Untuk mendapatkan sediaan spermatozoa dalam bentuk kering diterapkan metode pengeringbekuan yang diadopsi dari Kaneko et al. (2003) dengan sedikit modifikasi. Secara jelas dapat diuraikan sebagai berikut. Spermatozoa terlebih dahulu dibebaskan dari plasmanya dengan menggunakan metode swim up. Sebanyak 100 μl  (2 x 109 spermatozoa/ml) semen domba dimasukkan ke dalam tube 1.5 ml kemudian ditambahkan secara perlahan-lahan medium pelarut ethylene glycol-bis [beta-aminoethyl ether]-N,N,N’,N’-tetraacetic acid (EGTA) (Sigma), ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA) (Sigma) atau phosphate buffer saline (PBS) (Sigma) sebanyak 1.3 ml dengan pH 8.0.  Selanjutnya dilakukan inkubasi pada suhu 37 oC selama 10 menit agar spermatozoa dapat berenang ke permukaan medium. Fraksi spermatozoa yang berada di bagian atas medium diambil secara perlahan-lahan dan dipindahkan masing-masing sebanyak 100 μl ke dalam tube berpenutup ulir 1.5 ml  (Cryo-tube, Greiner). Tube tersebut selanjutnya dimasukkan ke dalam nitrogen cair hingga proses pengeringbekuan dimulai. Proses pengeringbekuan diawali dengan pemasangan tube ke alat pengeringbekuan, selanjutnya mesin dijalankan dan proses pengeringbekuan berjalan hingga terbentuk tepung spermatozoa di dalam tube tersebut. Tube selanjutnya dilepas dari mesin pengeringbekuan, ditutup rapat, divakum menggunakan syringe 10 ml dan disimpan di dalam lemari es hingga digunakan.

Penyiapan Oosit

Oosit diperoleh dari ovarium yang dikoleksi dari rumah potong hewan. Ovarium sebelumnya dimasukkan ke dalam medium NaCl fisiologis (0.9%), lalu dibawa ke laboratorium dalam waktu kurang dari 3 jam hingga proses aspirasi dilakukan. Aspirasi oosit menggunakan syringe 5 ml dan jarum 18G dengan medium TCM-199 (Sigma) yang ditambah 2% fetal bovine serum (FBS) (Sigma) dan antibiotik. Selanjutnya oosit dikumpulkan dan dicuci beberapa kali di dalam medium maturasi (TCM-199, NaHCO3 25 mM (Merck), FBS 10%, estrogen 1 mg/ml, FSH 10 μg/ml, LH 10 μg/ml dan antibiotik). Semua oosit hasil aspirasi belum matang sehingga harus dimatangkan sesuai dengan prosedur standar maturasi oosit. Proses maturasi oosit dimulai dengan menempatkan oosit ke dalam spot (50 μl) medium maturasi (10-15 oosit/spot) yang terdapat pada cawan petri.  Selanjutnya cawan tersebut dimasukkan ke dalam inkubator CO2 5%, suhu 38 oC selama 24 jam. Evaluasi oosit yang matang dilakukan di bawah mikroskop inverted dengan indikator adanya badan kutub pada oosit. Oosit yang mempunyai badan kutub pertama (oosit matang) selanjutnya dipisahkan  pada spot yang lain sambil menunggu proses intracytoplasmic sperm injection (ICSI) dilakukan.

Pelaksanaan Intracytoplasmic Sperm Injection (ICSI)

Metode ICSI yang digunakan pada penelitian ini merupakan metode mikro fertilisasi yang dikembangkan oleh Boediono (2001) dengan sedikit modifikasi.  Secara garis besar prosedur yang dimaksud adalah sebagai berikut. Pertama-tama dibuat drop medium ICSI (TCM-199, NaHCO3 5 mM, HEPES 20 mM, FBS 5% dan antibiotik) masing-masing sebanyak 5 μl pada cawan petri.  Drop pada sisi kiri diisi dengan oosit matang (terdapat badan kutub pertama, PB-I) sebanyak tiga sampai lima oosit yang telah dibebaskan dari kumulus dengan menggunakan enzim hyaluronidase, sedangkan drop pada sisi kanan merupakan drop yang berisi spermatozoa hasil pengeringbekuan. Di dalam pelaksanaan ICSI, spermatozoa terlebih dahulu ditempatkan pada ujung injection pipet yang berdiameter kurang dari 10 μm sebelum diinjeksikan ke dalam sitoplasma oosit yang telah difiksir dengan menggunakan holding pipet yang berdiameter 50-100 μm. Pipet injeksi harus berada pada posisi 90 derajat dari posisi  PB-I oosit.  Hal ini dimaksudkan agar pada saat pipet injeksi masuk ke dalam sitoplasma oosit, tidak akan merusak inti sel yang berada di dekat PB-I.  Selanjutnya, spermatozoa diinjeksikan ke dalam sitoplasma oosit dan pipet injeksi ditarik keluar sitoplasma.

Inkubasi Oosit Setelah ICSI

Setelah ICSI dilakukan, oosit dikeluarkan dari drop ICSI dan dicuci beberapa kali di dalam medium inkubasi (TCM-199, NaHCO3 25 mM, FBS 10% dan antibiotik).  Oosit yang telah dicuci dipindahkan ke dalam drop medium inkubasi (50 μl), untuk selanjutnya dimasukkan ke dalam inkubator di bawah kondisi CO2 5% dan suhu 38 oC selama 10 jam.   

Evaluasi Oosit setelah ICSI dan Analisis Data

Oosit hasil ICSI yang telah diinkubasi, selanjutnya dievaluasi dengan menggunakan metode pewarnaan aceto lacmoid (Toyoda dan Chang 1974). Prosedur pewarnaan aceto lacmoid dapat dijelaskan sebagai berikut. Oosit  yang telah diinkubasi selama 24 jam diletakkan di atas gelas obyek dan diberi gelas penutup. Selanjutnya oosit berturut-turut dibilas dengan glutaraldehyde 2.5%, difiksasi selama 24 jam di dalam formalin netral 10%, dibilas dengan etanol 95% dan diwarnai dengan aceto lacmoid serta dibilas acetoglycerol untuk membersihkan sisa pewarna. Pengamatan oosit hasil  pewarnaan dilakukan di bawah mikroskop cahaya dengan lensa obyektif 40X. Oosit hasil ICSI dikategorikan ke dalam 4 kelompok, yaitu oosit dengan spermatozoa dekondensasi (DS), oosit dengan satu pronukleus (1PN), oosit dengan dua pronukleus (2PN) dan oosit tidak teraktivasi.

Data tentang perkembangan spermatozoa dan pembentukan pronukleus setelah ICSI dengan menggunakan spermatozoa hasil pengeringbekuan dan spermatozoa segar pada masing-masing perlakuan dibandingkan dengan menggunakan independent-samples T-test yang terdapat di dalam program statistik SPSS versi 13 dengan taraf pengujian 5%. 

HASIL DAN PEMBAHASAN

Uji biologis dilakukan baik pada spermatozoa segar maupun spermatozoa hasil pengeringbekuan menggunakan metode intracytoplasmic sperm injection (ICSI), yaitu memasukkan spermatozoon secara mekanik ke dalam sitoplasma oosit dengan bantuan alat mikromanipulator di bawah mikroskop inverted. Data hasil ICSI yang menjelaskan tahap awal kejadian fertilisasi yang diindikasikan oleh kemampuan spermatozoa untuk berdekondensasi dan mendukung pembentukan pronukleus setelah ICSI disajikan pada Tabel 1.

Nilai persentase rata-rata oosit yang teraktivasi setelah diinjeksi dengan spermatozoon hasil pengeringbekuan dari semua perlakuan berkisar 0 – 60% (rata-rata 36%), sedangan ICSI menggunakan spermatozoa segar mencapai 70%. Kondisi aktivasi dibagi ke dalam beberapa kategori, yaitu oosit dengan dua pronukeus (2PN), oosit dengan satu pronukleus (1PN), oosit dengan spermatozoa yang dekondensasi (DS), dan oosit dengan spermatozoa yang tetap dalam kondisi terkondensasi (CS) atau oosit yang tidak teraktivasi.

Data pada Tabel 1 menunjukkan bahwa spermatozoa hasil pengeringbekuan yang diinjeksikan ke dalam oosit domba hanya 2% yang berkembang ke tahap dekondensasi dan 34% mampu mendukung pembentukan 1PN, tetapi belum mampu mendukung pembentukan 2PN. Sedangkan spermatozoa segar mampu mendukung pembentukan 1PN (40%) dan 2PN (30%) (Gambar 1). 

Tabel 1  Perkembangan spermatozoa dan pembentukan pronukleus setelah ICSI pada oosit domba

Sumber spermatozoa Jumlah oosit yang diinjeksi Jumlah oosit teraktivasi dengan: Jumlah oosit tdk teraktivasi (%)
DS (%) 1PN (%) 2PN (%) Total (%)
EDTA-1 20 0 (0) a 9 (45) c 0 (0) a 9 (45) c 11 (55) c
EDTA-2 20 0 (0) a 10 (50) c 0 (0) a 10 (50) c 10 (50) c
EDTA-3 20 0 (0) a 8 (40) c 0 (0) a 8 (40) c 12 (60) c
EGTA-1 20 0 (0) a 10 (50) c 0 (0) a 10 (50) c 10 (50) c
EGTA-2 20 2 (10) b 8 (40) c 0 (0) a 10 (50) c 10 (50) c
EGTA-3 20 2 (10) b 10 (50) c 0 (0) a 12 (60) cd 8 (40) cd
PBS-1 20 0 (0) a 2 (10) b 0 (0) a 2 (10) b 18 (90) bc
PBS-2 20 0 (0) a 4 (20) b 0 (0) a 4 (20) b 16 (80) b
PBS-3 20 0 (0) a 0 (0) a 0 (0) a 0 (0) a 20 (100) a
Kontrol 20 0 (0) a 8 (40) c 6 (30) b 14 (70) d 6 (30) d

Keterangan: DS=decondesed spermatozoa, 1PN=satu pronukleus, 2PN=dua pronukleus

Angka yang diikuti huruf superskript berbeda pada kolom yang sama menunjukkan perbedaan yang nyata pada taraf uji 5%.

Persentase tertinggi (60%) oosit yang teraktivasi setelah diinjeksi dengan menggunakan spermatozoa hasil pengeringbekuan ditunjukkan oleh perlakuan EGTA-3 yang berbeda nyata lebih tinggi (P<0.05) dibandingkan dengan perlakuan PBS-1 (10%), PBS-2 (20%) dan PBS-3 (0%). Walaupun persentase keberhasilan oosit teraktivasi yang diinjeksi dengan menggunakan spermatozoa hasil pengeringbekuan, khususnya pada perlakuan EGTA-3, tidak berbeda nyata dengan injeksi yang menggunakan spermatozoa segar (kontrol), tetapi secara umum dapat dikatakan bahwa injeksi dengan menggunakan spermatozoa segar dapat mencapai rata-rata keberhasilan aktivasi oosit yang nyata lebih besar (70%) dibandingkan dengan injeksi yang menggunakan spermatozoa hasil pengeringbekuan. 

Secara umum fenomena ini mungkin disebabkan oleh kerusakan faktor paternal selama proses pengeringbekuan sehingga proses fertilisasi menjadi terhambat. Yanagimachi (2001) mengatakan bahwa sentrosom spermatozoa mamalia turut berpartisipasi dalam proses fertilisasi, sedangkan sentrosom spermatozoa hewan rodensia tidak dibutuhkan pada proses fertilisasi karena sentrosom maternal telah cukup melakukan tugas tersebut.

 

Gambar 1  Oosit dengan 2PN (A), oosit dengan 1PN (B), oosit dengan spermatozoa yang terdekondensasi, DS (C), dan oosit dengan spermatozoa yang tidak berkembang,CS (D)
 
 
 
 
 
 

Peristiwa aktivasi oosit hingga terbentuknya pronukleus betina pada fertilisasi umumnya disebabkan oleh spermatozoa melalui suatu zat yang disebut oocytes activating factor (OAF). Zat ini akan merangsang pengeluaran ion kalsium intraseluler melalui second messenger inositol tri phosphate (IP3). Peningkatan mobilisasi ion kalsium di dalam sel akan merangsang terjadinya proses meiosis kedua yang menyebabkan keluarnya polar body kedua (PB II) dan terbentuknya pronukleus betina. Pada sisi lain,  pembentukan pronukleus jantan sangat tergantung pada kondisi sitoplasma oosit. Spermatozoa yang diinjeksikan ke dalam oosit yang belum matang atau belum mengalami germinal vesicle breakdown (GVBD) tidak akan menyebabkan dekondensasi pada inti spermatozoa (Thadani 1980).  Sebaliknya jika spermatozoa dimasukkan ke dalam oosit yang telah mengalami GVBD, maka akan terjadi dekondensasi inti spermatozoa dan selanjutnya terjadi pembentukan pronukleus jantan (Balakier dan Tarkowski 1980).

Salah satu faktor yang dicurigai sebagai penyebab proses dekondensasi inti spermatozoa adalah glutathion (GSH) yang terdapat secara alami di dalam sitoplasma oosit. Glutathion berfungsi mereduksi ikatan sulfihidril protamin pada inti spermatozoa sehingga kromatin terbuka (dekondensasi) dan selanjutnya pembentukan pronukleus jantan dapat berlangsung dengan baik (Mahi dan Yanagimachi 1975). Kegagalan pembentukan pronukleuas jantan pada oosit yang diinjeksi dengan spermatozoa hasil pengeringbekuan mungkin disebabkan oleh kurang berfungsinya GSH pada oosit sehingga inti spermatozoa tetap terkondensasi. Hal ini dapat dilihat dari rendahnya rata-rata angka dekondensasi (2%) pada semua perlakuan yang menggunakan spermatozoa hasil pengeringbekuan.

Hal lain yang mungkin menyebabkan tidak terbentuknya pronukleus jantan pada oosit yang  diinjeksi dengan spermatozoa hasil pengeringbekuan adalah tidak adanya tindakan aktivasi buatan selama masa inkubasi oosit setelah ICSI. Beberapa peneliti mengungkapkan bahwa pembentukan pronukleus jantan tidak hanya bergantung pada terjadinya GVBD pada oosit tetapi juga sangat tergantung pada proses aktivasi (Niwa dan Chang 1975; Balakier dan Tarkowski 1980; Perreault et al. 1984). Selanjutnya dikatakan oleh Niwa dan Chang (1975) bahwa walaupun telah terjadi dekondensasi inti spermatozoa setelah ICSI, tetapi pronukleus jantan tidak akan terbentuk sebelum dilakukan aktivasi.

KESIMPULAN

Hasil penelitian ini menyimpulkan bahwa spermatozoa domba hasil pengeringbekuan dapat melakukan dekondensasi sebagai indikator awal kejadian fertilisasi dan mendukung pembentukan satu pronukleus (1PN) di dalam oosit, tetapi belum mampu mendukung pembentukan dua pronukleus (2PN) setelah ICSI. Sedangkan injeksi dengan menggunakan spermatozoa segar mampu  mendukung pembentukan 1PN  dan 2PN.

DAFTAR PUSTAKA

Balakier HG, Tarkowski AK.  1980.  The role of germinal vesicle karyoplasm in the development of male pronucleus in the mouse.  Exp Cell Res  128:79-85.

Boediono A. 2001. Sperm immobilization prior to intracytoplasmic sperm injection (ICSI) and oocyte activation improves early development of microfertilized goat oocytes. Reprotech 1 (1):29-34.

Hoshi K, Yanagida K, Katayose H, Yazawa H. 1994.  Pronuclear formation and cleavage of mammalian eggs after microsurgical injection of freeze-dried sperm nuclei. Zygote 2:237-242.

Kaneko T, Whittingham DG, Yanagimachi R.  2003.  Effect of pH value of freeze-drying solution on the chromosome integrity and developmental ability of mouse spermatozoa. Biol Reprod  68:136-139.

Katayose H, Matsuda J, Yanagimachi R. 1992. The ability of dehydrated hamster and human sperm nuclei to develop into pronuclei.  Biol Reprod  47:277-284.

Keskintepe L, Hassan A, Khan I, Stice SL.  2001.  Bovine embryo development after lyophilized sperm injection. Theriogenology  55:505 (Abstract).

Kwon IK, Park KE, Niwa K.  2004. Activation, pronuclear formation and development in vitro of pig oocytes following intracytoplasmic injection of freeze-dried spermatozoa. Biol Reprod  71:1430-1436.

Liu JL, Kusakabe H, Chang CC, Suzuki H, Schmidt DW, Julian M, Pfeffer R, Bormann CL, Tian XC, Yanagimachi R, Yang XZ. 2004. Freeze-dried sperm fertilization leads to full-term development in rabbits.  Biol Reprod  70:1776-81.

Mahi CA, Yanagimachi R.  1975.  Induction of nuclear decondensation of mammalian spermatozoa in vitroJ Reprod Fertil  44:293-296.

Niwa K, Chang MC.  1975.  Fertilization of rat eggs in vitro at various times before and after ovulation with special reference to fertilization of ovarian oocytes matured in culture. J Reprod Fertil  43:435-451. 

Perreault SD, Wolff RA, Zirkin BR. 1984.  The role of disulfide bond reduction during mammalian sperm nuclear decondensation in vivoDev Biol  101:160-167.  

Said S.  2003.  Studies on fertilization of rat oocytes by intracytoplasmic sperm injection [dissertation]. The Graduate School of Natural Science and Technology Okayama University, Okayama-Japan

Saili T, Setiadi MA, Agungpriyono S, Toelihere MR, Boediono A.  2006.  Pengaruh pengeringbekuan terhadap perubahan morfologi spermatozoa domba. Agriplus 16:107-117.

Thadani VM.  1980.  A study of hetero-specific sperm-egg interaction in the rat, mouse and deer mouse using in vitro fertilization and sperm injection. J Exp Zool  212:436-453 

Toyoda Y, Chang MC. 1974. Fertilization of rat eggs in vitro by epididymal spermatozoa and the development of eggs following transfer. J Reprod Fertil  36:9-22.

Wakayama T, Yanagimachi R. 1998. Development of normal mice from oocytes injected with freeze-dried spermatozoa. Nat Biotech 16:639-641.

Watson PF.  1990.  Artificial insemination and the preservation of semen. In Lemming (ed). Marshall’s Physiology of Reproduction. Edinburgh: Churchill Livingston. Pp 747-869. 

Yanagida K, Yanagimachi R, Perreault SD, Kleinfeld RG. 1991.  Thermostability of sperm nuclei assessed by microinjection into hamster oocytes. Biol Reprod  44:440-447.

Yanagimachi R. 2001. Gamete manipulation for development: new methods for conception.  Reprod Fertil Dev 13:3-14.

Status DNA Spermatozoa Domba setelah Proses Pengeringbekuan

February 3, 2010

Status DNA Spermatozoa Domba setelah Proses Pengeringbekuan

 TAKDIR SAILI1*, WAHONO ESTHI PRASETYANINGTYAS2, MOHAMAD AGUS SETIADI3,  SRIHADI AGUNGPRIYONO2, dan ARIEF BOEDIONO2

 1Jurusan Produksi Ternak, Fakultas Pertanian, Universitas Haluoleo, Kendari 93232

2Departemen Anatomi, Fisiologi dan Farmakologi, Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor, Kampus Darmaga, Bogor 16680

3Deaprtemen Klinik, Reproduksi dan Patologi, Fakultas Kedokteran Hewan Institut Pertanian Bogor,

Kampus Darmaga, Bogor 16680

*E-mail: takdir69@yahoo.com

 ABSTRACT

 SAILI, T., W.E. PRASETYANINGTYAS, M.A. SETIADI, S. AGUNGPRIYONO, and A. BOEDIONO.  2006.  Status of Ram Spermatozoa DNA after Freeze-drying Process.

 The process of freeze drying caused detrimental effect on plasma membrane and acrosome of the spermatozoa, even it potentially could alter the chromatin and DNA integrity of the spermatozoa. On the other hand, DNA integrity of spermatozoa is essential for spermatozoa to participate in pronucleus formation during fertilization event. Therefore the evaluation of DNA integrity should be carried out to study the effect of freeze drying process. EDTA, EGTA, and PBS were used as dilution media of spermatozoa prior to freeze drying process to protect DNA of spermatozoa. Toluidine blue staining and comet assay methods were used to evaluate the alteration on chromatin and DNA integrity of spermatozoa, respectively. The results revealed that the high compacted chromatin of 6 months storage of freeze-dried spermatozoa were obtained from EGTA-3 (98%) and EGTA-1 (97%) treatments that had significant differences compared to all PBS treatments (90-92%), but not for fresh spermatozoa (100%). Whereas, the high compacted DNA integrity of freeze-dried spermatozoa were obtained from EGTA-2 (92%) and EGTA-3 (92%) but had no significant differences compared to other treatments including fresh spermatozoa (97%). These results demonstrate that EDTA and EGTA tend to be able to protect chromatin and DNA integrities of ram spermatozoa during freeze-drying and storage compared to PBS

Key words : freeze-drying, spermatozoa, DNA, toluidine blue, comet assay

 ABSTRAK

SAILI, T., W.E. PRASETYANINGTYAS, M.A. SETIADI, S. AGUNGPRIYONO, and A. BOEDIONO.  2006.  Status DNA Spermatozoa Domba setelah Proses Pengeringbekuan.

Proses pengeringbekuan menyebabkan kerusakan pada membran plasma dan akrosom spermatozoa bahkan berpotensi dapat mengubah integritas kromatin dan DNA spermatozoa. Pada sisi lain, integritas DNA sangat penting bagi spermatozoa untuk berperan dalam proses pembentukan pronukleus pada peristiwa fertilisasi. Oleh karena itu, evaluasi tentang integritas DNA spermatozoa harus dilakukan untuk melihat pengaruh proses pengeringbekuan. Media EDTA, EGTA dan PBS digunakan sebagai pelarut spermatozoa sebelum proses pengeringbekuan. Metode pewarnaan toluidine blue dan comet assay, masing-masing digunakan untuk mengevaluasi perubahan integritas kromatin dan DNA spermatozoa. Hasil penelitian menunjukkan bahwa persentase tertinggi integritas kromatin spermatozoa domba hasil pengeringbekuan yang disimpan selama 6 bulan pada lemari es diperoleh pada perlakuan EGTA-3 (98%) dan EGTA-1 (97%) yang berbeda nyata lebih tinggi dengan semua perlakuan PBS (90-92%) dan EDTA-2 (91%), tetapi tidak berbeda nyata dengan perlakuan EDTA-1 (93%), EDTA-3 (94%) dan spermatozoa segar (100%). Sedangkan persentase tertinggi integritas DNA spermatozoa domba hasil pengeringbekuan diperoleh pada perlakuan EGTA-2 (92%) dan EGTA-3 (92%), walaupun tidak berbeda dengan semua perlakuan yang lain (83-90%) termasuk spermatozoa segar (97%). Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa  EDTA dan EGTA cenderung lebih baik dibandingkan dengan PBS dalam mempertahankan integritas kromatin dan DNA spermatozoa domba selama pengeringbekuan dan penyimpanan.

Kata Kunci: Pengeringbekuan, spermatozoa, DNA, toluidine blue, comet assay

 PENDAHULUAN

Pengeringbekuan merupakan salah satu metode pengawetan spermatozoa melalui proses pembekuan dan penyubliman yang pada akhirnya akan dihasilkan sediaan spermatozoa dalam kemasan kering. Selama masa penyimpanan, kemasan spermatozoa kering dapat ditempatkan pada lemari es sehingga tidak membutuhkan suplai nitrogen cair yang terus-menerus seperti penyimpanan spermatozoa dalam kemasan beku. Hal ini akan mempermudah penyimpanan dan pendistribusiannya dari satu tempat ke tempat lain.

Pada proses pengeringbekuan, spermatozoa terlebih dahulu dipapar pada nitrogen cair dengan suhu -196 oC untuk mendapatkan sediaan spermatozoa dalam keadaan beku. Selanjutnya dilakukan sublimasi untuk menguapkan fase air yang telah membeku sehingga pada akhirnya akan didapatkan sediaan spermatozoa dalam bentuk kering.  Kedua proses ini dapat mengubah status membran plasma dan akrosom serta morfologi spermatozoa (SAILI et al., 2006) bahkan mungkin dapat mengganggu kestabilan DNA yang terdapat di dalam struktur kromatin spermatozoa tersebut.

Komponen utama inti suatu sel adalah kromatin yang mengandung DNA dan protein pelindung. Kromatin terdiri atas serat-serat yang berwarna terang dengan diameter 15 sampai 20 nm yang membentang dari satu sisi ke sisi lain pada inti sel. Jika suatu sel membelah, maka pilinan serat DNA kromatin akan merapat dan memadat, sehingga menjadi lebih pendek dan tebal. Pada tahap seperti inilah kromatin tersebut berubah menjadi kromosom, yang berasal dari kata croma yang berarti berwarna dan soma yang berarti badan (PILIANG dan DJOJOSOEBAGIO, 1991).  

Kromatin spermatozoa mamalia terdapat pada inti di bagian kepala spermatozoa yang tersusun dari kumpulan DNA dan protein-protein dasar seperti protamin yang kaya akan asam amino arginin dan sistein (CURRY dan WATSON, 1995). Protamin berikatan erat dengan gugus fosfat pada tubuh DNA sehingga akan terbentuk struktur yang kokoh pada kromatin.  Selain itu, struktur kromatin juga diperkuat oleh ikatan kovalen (disulfida) yang terbentuk dari dua asam amino sistein pada molekul protamin yang berbeda dan ikatan silang disulfida antara asam amino sistein dalam satu molekul protamin. Ikatan silang sesama gugus sistein ini terbentuk selama proses spermatogenesis khususnya pada saat melewati epididimis. Selanjutnya dikatakan bahwa kromatin mempunyai struktur pelindung yang berlapis, walaupun fungsi setiap lapisan tersebut hingga saat ini belum teridentifikasi dengan baik. DNA yang terdapat di dalam struktur kromatin tersebut membentuk koil dan terlindung oleh matriks yang padat sehingga tahan terhadap pengaruh zat kimia seperti enzim DNAse I atau pengaruh fisik berupa sonikasi (MOHAR et al., 2002).

Pada kepala spermatozoa  terdapat inti yang mengandung DNA yang merupakan komponen vital dalam proses fertilisasi. Semua informasi genetik paternal yang akan diwariskan dari satu generasi ke generasi berikutnya terdapat pada untaian DNA di dalam kromosom inti spermatozoa.  Oleh karena itu, pemeriksaan terhadap kondisi DNA spermatozoa sangat penting dilakukan. Berbagai metode analisis keutuhan DNA spermatozoa dan sel somatis telah digunakan antara lain sperm chromatin structure assay (SCSA) (EVENSON et al., 1980), acridine orange test (AO) (TEJADA et al., 1984), terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) nick-end labelling (TUNEL) (GORCYZA et al., 1993a), in-situ nick translation assay (NT) (MANICARDI et al., 1995), toluidine blue test (TB) (ERENPREISS et al., 2001) dan comet assay (FRASER dan STRZEZEK 2004).  Metode pemeriksaan yang menggunakan zat warna seperti AO dan TB merupakan metode pemeriksaan status DNA spermatozoa secara tidak langsung karena hanya memeriksa perubahan struktur kromatin spermatozoa yang berhubungan erat dengan kondisi kestabilan DNA spermatozoa tersebut (ERENPREISA et al., 2003.

Pada penelitian lain dilaporkan bahwa spermatozoa mempunyai kemampuan untuk merusak DNA-nya sendiri karena secara intrinsik mengandung enzim endonuklease. Hal ini dapat dibuktikan dengan pemberian Triton-X yang dikombinasikan dengan MgCl2 mampu mengaktifkan kerja endonuklease sehingga integritas DNA menjadi terganggu. Munculnya beberapa fragmen DNA yang berukuran sama dengan fragmen DNA pada spermatozoa yang diberi perlakuan DNAse I merupakan bukti adanya aktivitas endonuklease selama inkubasi. Selanjutnya dikatakan bahwa spermatozoa yang mendapat perlakuan EDTA cenderung dapat mempertahankan integritas DNA-nya dibanding tanpa pemberian EDTA (SOTOLONGO et al., 2003).

Pada penelitian ini digunakan tiga jenis medium pelarut spermatozoa, yaitu ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA), ethylene glycol-bis [beta-aminoethyl ether]-N,N,N’,N’-tetraacetic acid (EGTA) dan phosphate buffer saline (PBS).  Senyawa EDTA dan EGTA merupakan dua senyawa kimia yang berfungsi sebagai chelating agent yang dapat menangkap kation, sedangkan PBS merupakan medium yang umum digunakan sebagai  pelarut sel karena mempunyai tekanan osmotik yang isotonis dengan tekanan osmotik sel pada umumnya. Senyawa EDTA dan EGTA dapat mengikat ion metal terutama ion dengan valensi dua, seperti Mg2+, Mn2+, Zn2+, dan Ca2+. Ion-ion tersebut sangat bermanfaat bagi kerja enzim sehingga enzim tidak dapat bekerja dengan baik atau aktivitas enzim berhenti sama sekali jika ion-ion tersebut ditangkap. Senyawa EDTA mempunyai afinitas yang tinggi terhadap ion Mg2+, sedangkan EGTA mempunyai afinitas yang tinggi terhadap ion Ca2+ (ANONIM,  2005).

Untuk menganalisis perubahan integritas kromatin dan DNA spermatozoa setelah pengeringbekuan dan penyimpanan selama 6 bulan di dalam lemari es (suhu 3-5 oC) berturut-turut digunakan metode pewarnaan toluidne blue (ERENPREISS et al., 2001) dan metode comet assay (FRASER dan STRZEZEK, 2004). Sebagai pembanding juga dilakukan analisis terhadap status kromatin dan DNA spermatozoa segar.

BAHAN DAN METODE

Tempat dan Waktu Penelitian

Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Embriologi, Laboratorium Riset Anatomi, Laboratorium Histologi, dan Laboratorium Pendidikan dan Pelayanan Terpadu serta Unit Rehabilitasi Reproduksi, dan Unit Produksi Bahan Biologis Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor pada bulan Januari sampai dengan bulan Agustus 2005.

Penyiapan Spermatozoa

Spermatozoa yang digunakan pada penelitian ini terdiri atas spermatozoa segar dan spermatozoa hasil pengeringbekuan. Sedangkan metode pengeringbekuan spermatozoa yang digunakan diadopsi dari KANEKO et al., (2003) dengan sedikit modifikasi. Di dalam proses pengeringbekuan digunakan tiga jenis media, yaitu: 1). medium ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA) yang mengandung EDTA 50 mM, NaCl 50 mM dan penyangga Tris-HCl 10 mM, 2). medium ethylene glycol-bis [beta-aminoethyl ether]-N,N,N’,N’-tetraacetic acid (EGTA) yang mengandung EGTA 50 mM, NaCl 50 mM dan penyangga Tris-HCl 10 mM, dan 3). medium phosphate-buffered saline (PBS) masing-masing sebagai medium pelarut spermatozoa. Secara jelas prosedur pengeringbekuan dapat diuraikan sebagai berikut. Sejumlah 50 μl semen domba dengan konsentrasi 3 x 109 spermatozoa/ml dimasukkan ke dalam tube 1,5 ml kemudian ditambahkan medium pelarut EDTA, EGTA atau PBS dengan pH 8,0 sebanyak 1,3 ml. Selanjutnya campuran semen tersebut diinkubasi pada suhu 37 oC  selama 10 menit. Fraksi spermatozoa yang berada di bagian atas tube diambil secara perlahan-lahan dan dipindahkan masing-masing sebanyak 100 μl ke dalam tube berpenutup ulir 1,5 ml  (Cryo-tube, Greiner). Tube tersebut selanjutnya dimasukkan ke dalam nitrogen cair hingga proses pengeringbekuan dimulai. Proses pengeringbekuan diawali dengan pemasangan tube ke alat pengeringbekuan, selanjutnya mesin dijalankan dan proses pengeringbekuan berjalan hingga terbentuk tepung spermatozoa di dalam tube tersebut. Waktu pengeringbekuan 1, 2, 3 jam digunakan sebagai perlakuan. Tube selanjutnya dilepas dari mesin pengeringbekuan, ditutup rapat, divakum dengan menggunakan syringe 10 ml dan disimpan di dalam lemari es  (3-5 oC  ) selama 6 bulan.

Evaluasi Status DNA Spermatozoa

Pada penelitian ini dilakukan dua pendekatan untuk mengevaluasi integritas DNA spermatozoa domba setelah proses pengeringbekuan dan penyimpanan selama 6 bulan di dalam lemari es (3-5 oC). Pendekatan pertama bertujuan untuk memprediksi kondisi DNA spermatozoa secara tidak langsung berdasarkan perubahan struktur kromatin dengan menggunakan teknik pewarnaan toluidine blue. Pada pemeriksaan ini diungkap kondisi kondensasi kromatin berdasarkan perbedaan intensitas warna yang dihasilkan. Selama spermatogenesis, protein pelindung spermatozoa yang disebut histon akan digantikan oleh protamin. Perubahan ini akan menentukan kualitas proses kondensasi kromatin yang dapat dideteksi melalui teknik pewarnaan toluidine blue. Semakin kompak kondensasi yang terjadi, maka warna biru terang akan muncul, sebaliknya pada kondensasi yang kurang kompak warna biru gelap akan muncul (BELETTI dan MELLO, 2004).  Kondensasi yang kurang kompak berkorelasi positif dengan abnormalitas kromatin dan DNA spermatozoa, seperti umumnya yang terdapat pada pasien pria infertil. Kondisi ini juga dapat terjadi pada spermatozoa yang terpapar oleh radikal bebas (AITKEN et al.,  1998) atau akibat apoptosis (GORCYZA et al., 1993b).

Metode pewarnaan TB diawali dengan pembuatan preparat ulas spermatozoa pada gelas obyek. Preparat selanjutnya dikeringudarakan dan difiksasi di dalam etanol 96%-aseton (1:1) selama 30 menit pada suhu 4 oC.  Setelah difiksasi, preparat dikeringudarakan sebelum dihidrolisis di dalam HCl 0,1N selama 5 menit pada suhu 4 oC. Pewarnaan TB 0,05% dilakukan setelah preparat dibilas tiga kali dengan menggunakan distilled water (DW). Preparat yang telah diwarnai dicuci kembali dengan DW dan didehidrasi dengan menggunakan t-butanol dua kali serta dibersihkan dengan menggunakan xylol sebanyak dua kali. Preparat, kemudian ditutup dengan gelas penutup dan diamati di bawah mikroskop cahaya menggunakan lensa obyektif 40X. Kepala spermatozoa yang integritas kromatinnya masih baik akan berwarna biru terang, sedangkan spermatozoa yang integritas kromatinnya sudah berkurang akan berwarna violet. Pemeriksaan dilakukan terhadap 200 spermatozoa untuk setiap perlakuan.

Sedangkan pada pendekatan kedua yang menggunakan metode comet assay dapat dibedakan langsung secara visual antara DNA spermatozoa yang utuh dan DNA spermatozoa yang tidak utuh (mengalami fragmentasi) berdasarkan pembentukan komet setelah proses elektroforesis dan pewarnaan menggunakan propidium iodide (PI). Pada prosedur comet assay spermatozoa terlebih dahulu diinkubasi di dalam β-mercaptoethanol 2% yang umum digunakan untuk melisis sel guna mengisolasi DNA. Selain itu juga digunakan beberapa jenis detergen (Triton X-100 dan lauryl sarcosine) untuk melisis membran sel dan proteinase-K untuk memutuskan komplek protein-DNA.

Evaluasi status DNA spermatozoa yang menggunakan prosedur comet assay dapat diuraikan sebagai berikut. Sampel spermatozoa yang akan diamati dilisis terlebih dahulu dengan menggunakan β-mercaptoethanol 2% selama satu jam di dalam lemari es (suhu 3-5 oC). Selanjutnya sampel spermatozoa sebanyak 10 µl dengan konsentrasi 10 x 105 spermatozoa per mililiter dicampur dengan 90 µl low melting point agarose (LMA) 0,5%. Campuran tersebut selanjutnya ditambahkan ke dalam cetakan agarose pada gelas obyek yang terlebih dahulu diisi dengan 300 µl normal melting point agarose (NMA) 0,75%. Gelas obyek selanjutnya ditempatkan pada lemari es hingga campuran tersebut memadat. Selanjutnya sampel dilisis dua kali masing-masing menggunakan lysis buffer yang mengandung NaCl 2,5 M, NaEDTA 100 mM, Tris-HCl 10 mM, Triton X-100 1% dan sodium lauryl sarcosine 1%, pH 10 selama satu jam pada lemari es dan lysis buffer yang mengandung NaCl 2,5 M, Tris-HCl 5 mM, sodium lauryl sarcosine 0,05% dan proteinase K 100 µl/ml, pH 7,4 selama 1 malam pada suhu 37 oC. Setelah larutan ptoteinase-K ditiriskan dan dikeringkan serta diequilibrasi di dalam larutan NaOH 300 mM dan EDTA 1 mM, pH 13 (larutan alkali), sampel dimasukkan ke dalam bak pulse field gel electrophoresis (PFGE) yang berisi larutan alkali. Elektroforesis dilakukan pada kondisi 10 V, 300 mA, E/W 10, N/S 10, selama empat jam.  Selanjutnya sampel diangkat dan dicuci tiga kali dengan menggunakan larutan penetral Tris 0,4 M, pH 7,4 untuk menghilangkan alkali dan detergen. Setelah dinetralkan, sampel diwarnai dengan propidium iodide (20μg/ml) dan ditutup dengan gelas penutup. Pengamatan dilakukan di bawah mikroskop fluoresens dengan filter TxRed (Ex = 540-580, DM = 595 dan BA = 600-660) (Nikon Eclipse E600, Japan). Spermatozoa dengan DNA utuh tidak memperlihatkan bias cahaya (komet), sedangkan spermatozoa dengan DNA yang tidak utuh akan memperlihatkan bias cahaya (komet). Jumlah spermatozoa yang diamati dalam setiap perlakuan adalah 100.

Rancangan Percobaan dan Analisis Data

Penelitian ini dirancang dengan menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) pola faktorial 3 x 3 dengan lima ulangan dan satuan percobaannya adalah gelas obyek yang berisi preparat spermatozoa yang diamati. Faktor pertama adalah jenis medium pelarut spermatozoa yang terdiri atas medium EDTA, EGTA dan PBS. Sedangkan faktor kedua adalah waktu pengeringbekuan spermatozoa di dalam mesin pengeringbekuan yang terdiri atas satu, dua dan tiga jam.

Peubah yang diamati pada penelitian ini adalah integritas DNA spermatozoa hasil pengeringbekuan dan spermatozoa segar dengan menggunakan metode pewarnaan toluidine blue test dan metode comet assay. Melalui metode pewarnaan toluidine blue test kepala spermatozoa yang integritas kromatinnya masih baik akan berwarna biru terang dan spermatozoa yang integritas kromatinnya sudah berkurang akan berwarna violet. Sedangkan melalui metode comet assay spermatozoa dengan DNA utuh tidak memperlihatkan bias cahaya (komet) dan spermatozoa dengan DNA yang tidak utuh akan memperlihatkan bias cahaya (komet). Data status DNA spermatozoa segar dan hasil pengeringbekuan dianalisis menggunakan independent-samples T-test yang terdapat di dalam program statistik SPSS versi 13 dengan taraf pengujian 5%.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Keberadaan kromatin dalam inti sel sangat menentukan status DNA yang terikat erat pada protamin yang berfungsi sebagai pelindung bagi DNA inti. Perubahan yang terjadi pada kromatin akan berakibat pada perubahan status DNA, sehingga pemeriksaan kondisi kromatin dapat menggambarkan status DNA yang terdapat di dalam kromatin tersebut. Data hasil evaluasi integritas DNA spermatozoa domba dengan menggunakan teknik pewarnaan toluidine blue dan metode comet assay, masing-masing disajikan pada Tabel 1 dan Tabel 2, sedangkan data visualnya disajikan pada Gambar 1 (pewarnaan toluidine blue) dan Gambar 2 (metode comet assay).

Tabel 1  Rata-rata persentase integritas kromatin spermatozoa domba hasil pengeringbekuan menggunakan metode pewarnaan toluidine blue (ERENPREISS et al., 2001)

Perlakuan Integritas kromatin (%)
Kompak           Tidak kompak
EDTA-1 186 (93)bc          14 (7)bc
EDTA-2 182 (91)b          18 (9)b
EDTA-3 188 (94)bc          12 (6)bc
EGTA-1 194 (97)ac            6 (3)ac
EGTA-2 190 (95)bc          10 (5)bc
EGTA-3 196 (98)ac            4 (2)ac
PBS-1 180 (90)b          20 (10)b
PBS-2 184 (92)b          16 (8)b
PBS-3 181 (91)b          19 (9)b
Spermatozoa segar 200 (100)a            0 (0)a

Keterangan: Superskrip berbeda dalam kolom yang sama menunjukkan perbedaan yang nyata pada taraf uji 5%.

     1, 2, dan 3 = waktu pengeringbekuan

 

 Gambar 1   Integritas kromatin spermatozoa setelah pengeringbekuan dan pewarnaan toluidine blue (ERENPREISS et al., 2001). Spermatozoa dengan inti pada kepala berwarna biru terang, kromatin utuh (a) dan spermatozoa dengan       inti pada kepala berwarna biru gelap, kromatin tidak utuh (b)

Hasil pewarnaan toluidine blue menunjukkan bahwa persentase integritas kromatin spermatozoa segar (kontrol) berbeda nyata lebih tinggi (P<0,05) dibandingkan dengan persentase spermatozoa hasil pengeringbekuan baik pada perlakuan EDTA-1, EDTA-2, EDTA-3, PBS-1, PBS-2, PBS-3 maupun EGTA-2, tetapi tidak berbeda nyata (P>0,05) dengan perlakuan EGTA-1 dan EGTA-3. Hal ini menunjukkan bahwa medium EGTA dan lama pengeringbekuan satu dan tiga jam  (EGTA-1 dan EGTA-3) memberikan kondisi yang baik bagi perlindungan integritas kromatin spermatozoa selama proses pengeringbekuan dan penyimpanan selama 6 bulan di dalam lemari es. Sedangkan di antara spermatozoa hasil pengeringbekuan, perlakuan EGTA-3 (98%) dan EGTA-1 (97%) menunjukkan persentase integritas kromatin spermatozoa yang tertinggi dan berbeda nyata (P<0,05) lebih tinggi dibandingkan dengan perlakuan EDTA-2 (91%), PBS-1 (90%), PBS-2 (92%) dan PBS-3 (91%), tetapi tidak berbeda nyata (P>0,05) dengan perlakuan EDTA-1 (93%), EDTA-3 (94%) dan EGTA-2 (95%).

Hasil evaluasi integritas DNA spermatozoa domba dengan menggunakan metode comet assay menunjukkan bahwa persentase integritas DNA spermatozoa segar (kontrol) berbeda nyata lebih tinggi (P<0,05) dibandingkan dengan persentase integritas DNA spermatozoa hasil pengeringbekuan pada perlakuan EDTA-1, PBS-1 dan PBS-2, tetapi tidak berbeda nyata (P>0,05) dengan perlakuan EDTA-2, EDTA-3, EGTA-1, EGTA-2, EGTA-3 dan PBS-3. Hal ini menunjukkan bahwa EDTA dan EGTA cenderung mampu melindungi integritas DNA spermatozoa selama proses pengeringbekuan dan penyimpanan di dalam lemari es selama 6 bulan. Walaupun integritas DNA spermatozoa hasil pengeringbekuan secara keseluruhan tidak menunjukkan perbedaan yang nyata pada semua perlakuan, EGTA-2 dan EGTA-3 mampu memberikan perlindungan yang terbaik (92%) terhadap integritas DNA spermatozoa hasil pengeringbekuan. 

Tabel 2  Rata-rata persentase integritas DNA spermatozoa domba hasil pengeringbekuan menggunakan metode comet assay (FRASER dan STRZEZEK,  2004)

Perlakuan Integritas DNA (%)
Utuh           Tidak utuh
EDTA-1 85 (85)bc           15 (15)bc
EDTA-2 88 (88)ac           12 (12)ac
EDTA-3 89 (89)ac           11 (11)ac
EGTA-1 90 (90)ac           10 (10)ac
EGTA-2 92 (92)ac             8 (8)ac
EGTA-3 92 (92)ac             8 (8)ac
PBS-1 83 (83)bc           17 (17)bc
PBS-2 83 (83)bc           17 (17)bc
PBS-3 87 (87)ac           13 (13)ac
Spermatozoa segar 97 (97)a             3 (3)a

Keterangan: Superskrip berbeda dalam kolom yang sama menunjukkan perbedaan yang nyata pada taraf uji 5%.

     1, 2, dan 3 = waktu pengeringbekuan

Gambar 2   Integritas  DNA  spermatozoa setelah pengeringbekuan dan metode comet assay (FRASER dan STRZEZEK, 2004). Spermatozoa yang tidak membentuk komet, DNA utuh (b) dan spermatozoa yang membentuk komet (tanda panah), DNA tidak utuh (a)

 Senyawa EDTA dan EGTA adalah dua zat kimia yang dikenal baik sebagai chelating agent, yaitu senyawa kimia yang berperan sebagai penangkap ion-ion bebas yang berpotensi mengganggu kestabilan inti sel. EGTA berperan menekan fungsi kation divalen seperti kalsium (Ca2+) dan magnesium (Mg2+) yang mendukung kerja enzim endonuklease, sehingga proses pemutusan ikatan fosfodiester pada tubuh DNA oleh enzim endonuklease tidak terjadi (CLARK dan EICHHORN, 1974; KUSAKABE et al., 2001). Gugus tetra asetic acid pada lengan struktur bangun EGTA dan EDTA mempunyai afinitas yang kuat untuk mengikat ion-ion bebas. Namun demikian, EDTA mempunyai afinitas yang kuat terhadap Mg2+ dibanding ion yang lain sedangkan  EGTA mempunyai afinitas yang kuat terhadap Ca2+ (ANONIM, 2005).  Selain itu, konsentrasi EGTA dalam medium pelarut juga turut berperan untuk mengoptimalkan upaya mempertahankan integritas DNA spermatozoa. Pada penelitian ini digunakan konsentrasi EGTA dan EDTA masing-masing 50 mM sesuai dengan hasil laporan KUSAKABE et al. (2001) bahwa konsentrasi EGTA 50 mM mampu mempertahankan integritas DNA spermatozoa mencit dengan baik dibandingkan dengan konsentrasi 10 mM.  Lebih lanjut dikatakan bahwa oosit yang diinjeksi dengan spermatozoa hasil pengeringbekuan menggunakan medium EGTA mampu berkembang menjadi embrio tahap blastosis bahkan dapat melahirkan anak yang normal setelah ditransfer ke resipien.  Aktivitas enzim endonuklease dalam merusak struktur DNA juga ditentukan oleh pH medium. Sebagai contoh, enzim endonuklease (DNAse I) berfungsi optimal pada pH 7 dan stabil pada pH 5-6 sehingga jika dipapar pada medium dengan pH tinggi aktivitas enzim tersebut dalam merusak struktur DNA akan terganggu (KANEKO et al., 2003).  Pada penelitian ini digunakan pH medium yang sedikit bersifat alkali  (pH 8) untuk semua jenis medium pelarut sesuai dengan laporan KANEKO et al. (2003) bahwa pelarut spermatozoa pada saat pengeringbekuan dengan pH 8,0 akan mampu mempertahankan integritas kromosom dan perkembangan spermatozoa lebih lanjut.   Beberapa hal di atas diduga kuat menyebabkan adanya kecenderungan integritas kromatin dan DNA spermatozoa hasil pengeringbekuan yang terlebih dahulu dilarutkan pada medium yang mengandung EGTA atau EDTA dapat dipertahankan dengan baik dibandingkan dengan spermatozoa yang dilarutkan di dalam medium PBS. 

KESIMPULAN       

Berdasarkan hasil penelitian dapat disimpulkan bahwa medium EDTA dan EGTA mempunyai kecenderungan dapat mempertahankan dengan baik integritas kromatin dan DNA spermatozoa hasil pengeringbekuan dibandingkan dengan medium PBS dengan lama pengeringbekuan satu sampai tiga jam.

DAFTAR PUSTAKA

AITKEN, R.J,  E. Gordon, and D. HARKISS.  1998.  Relative impact of oxidative stress on the functional competence and the genomic integrity of human spermatozoa. Biol Reprod  59:1037-1046.

ANONIM. 2005. The differences between EDTA and EGTA. http://www.madsci.org/ posts/archives/2001-02/983222932.Bc.r.html. [30 Des  2005].

BELETTI, M.E. and M.L.S. MELLO.  2004.  Comparison between Toluidine Blue stain and the Feulgen reaction for evaluation of rabbit sperm chromatin condensation and their relationship with sperm morphology.  Theriogenology  62:398-402.

CLARK, P. and G.L. EICHHORN. 1974.  A predictable modification of enzyme specificity. Selective alteration of DNA bases by metal ions to promote cleavage specificity by deoxyribonuclease. Biochemistry 13:5098-5102.

CURRY, M.R. and P.F. WATSON. 1995.  Sperm Structure and Function. Di dalam: Grudzinskas JG, Yovich JL, editor. Gametes-The Spermatozoon. Cambridge University Press.  hlm. 45-69.

ERENPREISA, J., J. ERENPREISS, T. FREIVALDS, M. SLAIDINA, R. KRAMPE, J. BUTIKOVA, A. AVANOV, and D. PJANOVA.  2003.  Toluidine blue test for sperm DNA integrity and elaboration of image cytometry algorithm.  Cytometry 52A:19-27. 

ERENPREISS,  J., J. BARS, V. LIPATNIKOVA, J. ERENPREISA, and J. ZALKALNS.  2001.  Comparative study of cytochemical tests for sperm chromatin integrity. J Androl. 22:45-53.

EVENSON, D.P., Z. DRAZYNKIEWICZ, and M.R. MELAMED.  1980.  Relation of mammalian sperm chromatin heterogeneity to fertility.  Science  210:1131-1133.

FRASER, L. and  J. STRZEZEK.  2004.  The use of comet assay to assess DNA integrity of boar spermatozoa following liquid preservation at 5oC and 16oC.  Folia Histochemica et Cytobiologica 42:49-55.

GORCYZA, W., J. GONG, and Z. DRAZYNKIEWCZ.  1993a.  Detection of DNA strand breaks individual apoptotic cells by the in situ terminal deoxynucleotidyl  transferase and nick translation assay. Cancer Res  53:1945-1951.

GORCYZA, W., F. TRAGANOS, and H. JESIONOWSKA.  1993b.  Presence of DNA strand breaks and increased sensitivity of DNA in situ to denaturation in abnormal human sperm cells: analogy to apoptosis of somatic cells. Exp Cell Res  207:202-205. 

KANEKO, T., D.G. WHITTINGHAM, and R.YANAGIMACHI.  2003.  Effect of pH value of freeze-drying solution on the chromosome integrity and developmental ability of mouse spermatozoa. Biol Reprod  68:136-139.

KUSAKABE, H., M.A. SZCZYGIEL, D.G. WHITTINGHAM, and R. YANAGIMACHI. 2001.  Maintenance of genetic integrity in frozen and freeze-dried mouse spermatozoa. PNAS 98:13501-13506.

MANICARDI, G.C., P.G. BIANCHI, S. PANTANO, P. AZZONI, D. BIZZARO, U. BIANCHI, and D. SAKKAS.  1995.  Presence of endogenous nicks in DNA of ejaculated human spermatozoa and it relationship to chromomycin A3 accessibility.  Biol Reprod  52:864-867.

MOHAR, I., A.S. MONIKA, R. YANAGIMACHI, and W.S. WARD.  2002.  Sperm nuclear halos can transform into normal chromosomes after injection into oocytes.  Mol Reprod Dev 62:416-420.  

PILIANG, W.G. dan S. DJOJOSOEBAGIO.  1991.  Fisiologi Nutrisi. Vol.1. Departemen Pendidikan dan Kebudayaan. Direktorat Pendidikan Tinggi. Pusat Antar Universitas-Ilmu Hayat, Institut Pertanian Bogor.

SAILI, T., M.A. SETIADI, S. AGUNGPRIYONO, M.R. TOELIHERE, and A. BOEDIONO.  2006. Pengaruh pengeringbekuan terhadap perubahan morfologi spermatozoa domba. Agriplus,  16:107-117.

SOTOLONGO, B., E. LINO, and W.S. WARD.  2003.  Ability of hamster spermatozoa to digest their own DNA.  Biol Reprod  69:2029-2035.

TEJADA, R., J.C. MITCHELL, A. NORMAN, J.J. MARIK, and S. FRIEDMAN.  1984.  A test for the practical evaluation of male fertility by acridine orange (AO) fluorescence. Fertil Steril   42:87-91.

PENGARUH PENGERINGBEKUAN

February 3, 2010

 PENGARUH PENGERINGBEKUAN TERHADAP PERUBAHAN MORFOLOGI SPERMATOZOA DOMBA

oleh : TAKDIR SAILI1, MOHAMAD AGUS SETIADI2, SRIHADI AGUNGPRIYONO3, MOZES R.TOELIHERE2, ARIEF BOEDIONO3

ABSTRACT

Freeze drying is a technology of choise in cell preservation and have been widely applied in many types of cell include spermatozoa. So far, the successful of freeze drying in spermatozoa is limited only in rodents such as mouse and rabbit. Therefore, the technology should be applied in farm animal such as sheep to prove whether the successful would be obtained. Moreover, the information related to membrane plasm and acrosome status and morphological changes on ram spermatozoa after freeze drying and storage was very poor. The staining procedure was applied to prove the membrane plasm and acrosome changes on spermatozoa. The results revealed that the membrane plasm and acrosome of freeze-dried ram spermatozoa was disrupted and most of spermatozoa have morphological abnormally in its tail. Whereas during storage in refreegerator (3-5oC) up 9 months, both plasm and acrosome membrane status and morphological changes on spermatozoa tend to be stable.

Key words : freeze drying, spermatozoa, membrane plasm, acrosome

PENDAHULUAN

Penelitian tentang metode pengawetan spermatozoa dengan cara pengeringbekuan telah dilakukan pada beberapa pusat penelitian baik di Amerika (Ward et al. 2003), Jepang (Hoshi et al. 1994) maupun Australia (Pangestu et al. 2001). Metode ini pada awalnya dikembangkan untuk menjawab permasalahan dalam mengamankan sumber gamet jantan hewan percobaan (mencit) hasil rekayasa. Beberapa laboratorium yang menggunakan hewan mencit sebagai uji coba manipulasi genetik memilih untuk mengamankan sumber gamet jantan dalam kemasan spermatozoa hasil pengeringbekuan daripada memelihara pejantan mencit untuk mendapatkan sumber gamet (Kaneko et al. 2003; Ward et al. 2003). Hal ini dapat dipahami karena pemeliharaan hewan jantan memerlukan waktu dan biaya. Demikian halnya dengan penyimpanan spermatozoa dalam kemasan beku di dalam nitrogen cair membutuhkan peralatan dan biaya tambahan serta suplai nitrogen yang terus menerus selama penyimpanan. Sedangkan hasil pengawetan spermatozoa  yang menggunakan metode pengeringbekuan dapat disimpan pada lemari es (suhu 3-5 oC) atau suhu kamar sehingga dapat ditransportasikan dari satu tempat ke tempat lain dengan mudah.

Pada proses pengeringbekuan, spermatozoa terlebih dahulu dipapar pada nitrogen cair dengan suhu -196oC untuk mendapatkan sediaan spermatozoa dalam keadaan beku. Selanjutnya dilakukan sublimasi untuk menguapkan fase air yang telah membeku sehingga pada akhirnya akan didapatkan sediaan spermatozoa dalam bentuk kering.  Kedua proses ini berpotensi dapat mengubah morfologi spermatozoa bahkan mungkin dapat menghentikan fungsi biologis spermatozoa tersebut. Weitze dan Petzoldt (1992) melaporkan bahwa pendinginan dan pembekuan (Bag et al. 2002) dapat menyebabkan kerusakan pada membran plasma dan membran akrosom spermatozoa. Kerusakan membran ini pada gilirannya akan menurunkan viabilitas spermatozoa bahkan dapat menyebabkan kematian bagi spermatozoa. Namun demikian, dengan menggunakan metode intracytoplasmic sperm injection (ICSI), spermatozoa yang telah mengalami kerusakan membran plasma dan akrosom masih mempunyai kemampuan untuk membuahi sel telur.

Sejauh ini pengawetan spermatozoa dengan cara pengeringbekuan masih terbatas pada hewan laboratorium seperti mencit (Wakayama et al.  1998) dan kelinci (Liu et al.  2004). Pada hewan ternak, upaya pengawetan spermatozoa dengan cara pengeringbekuan telah dilakukan oleh Kwon et al. (2004) pada babi dan Keskintepe et al. (2002) pada sapi, sedangkan pada ternak domba belum pernah dilaporkan. Selain itu, informasi tentang pengaruh pengeringbekuan terhadap perubahan morfologi spermatozoa sangat dibutuhkan untuk mengetahui kondisi membran plasma dan akrosom spermatozoa hasil pengeringbekuan. Oleh karena itu pada penelitian ini akan dilakukan evaluasi terhadap perubahan morfologi spermatozoa domba setelah proses pengeringbekuan dan penyimpanan di dalam lemari es (3-5oC) dengan menggunakan metode pewarnaan.  Evaluasi terhadap kualitas semen dan spermatozoa segar juga akan dilakukan sebagai pembanding spermatozoa hasil pengeringbekuan.

 BAHAN DAN METODE

Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Embriologi dan Laboratorium Riset Anatomi serta Unit Rehabilitasi Reproduksi dan Unit Produksi Bahan Biologis Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor sejak bulan Juni 2004 sampai dengan bulan Maret 2005.

             Bahan yang digunakan adalah semen domba yang diperoleh secara berkala dari seekor domba jantan lokal dengan kisaran umur tiga sampai empat tahun dan bobot badan ± 45 kg.  Beberapa jenis medium yang digunakan pada penelitian ini adalah medium NaCl 0.032M dengan tekanan osmotik 53-63 mOsmol/l untuk pengamatan status membran plasma spermatozoa, medium formal salin untuk pengamatan keutuhan tudung akrosom spermatozoa dan medium phosphate buffer saline (PBS) pH 7.2 untuk pencuci dan pelarut spermatozoa.  Selain itu juga digunakan larutan eosin B 2% (Sigma, E8017) untuk pengamatan persentase spermatozoa hidup.

Di dalam proses pengeringbekuan digunakan tiga jenis medium, yaitu medium ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA) yang mengandung EDTA 50 mM, NaCl 50 mM dan penyangga Tris-HCl 10 mM, medium ethylene glycol-bis [beta-aminoethyl ether]-N,N,N’,N’-tetraacetic acid (EGTA) yang mengandung EGTA 50 mM, NaCl 50 mM dan penyangga Tris-HCl 10 mM, dan medium phosphate buffer saline (PBS) pH 7.2 masing-masing sebagai medium pelarut spermatozoa serta nitrogen cair untuk membekukan spermatozoa sebelum dikeringkan.

            Peralatan yang digunakan pada penelitian ini adalah seperangkat alat vagina buatan yang digunakan untuk penampungan semen. Sedangkan untuk membuat dan menyimpan medium digunakan alat timbang, mikropipet, gelas ukur, gelas erlemeyer dan botol kecil dalam berbagai ukuran. Gelas obyek dan gelas penutup digunakan untuk membuat preparat spermatozoa bagi berbagai keperluan pengamatan yang menggunakan mikroskop. Haemocytometer dan sentrifus masing-masing digunakan sebagai alat untuk menghitung konsentrasi spermatozoa dan mencuci spermatozoa. Di dalam proses pembuatan spermatozoa hasil pengeringbekuan dengan menggunakan metode pengeringbekuan digunakan tube berpenutup ulir 1.5 ml (Cryo-tube, Greiner) untuk menyimpan spermatozoa serta mesin pengeringbekuan (Flexy-dry) dan lemari es masing-masing untuk membuat sediaan spermatozoa hasil pengeringbekuan dan untuk menyimpan spermatozoa hasil pengeringbekuan. Selain itu juga digunakan kertas indikator pH, water bath, magnetic stirer, pencatat waktu dan lain-lain.

Koleksi dan evaluasi semen dan spermatozoa segar dilakukan dengan cara menampung semen seekor domba jantan lokal dengan menggunakan vagina buatan. Selanjutnya dilakukan evaluasi terhadap semen dan spermatozoa baik secara makroskopis (volume, warna, konsistensi dan derajat keasaman semen) maupun mikroskopis (gerakan massa, persentase motilitas, konsentrasi, persentase membran plasma utuh, persentase hidup dan persentase tudung akrosom utuh serta abnormalitas spermatozoa).

Volume semen diketahui dengan cara membaca skala pada tabung penampung semen. Demikian halnya dengan warna semen dapat langsung dilihat pada tabung penampung semen tersebut segera setelah semen ditampung. Sedangkan konsistensi semen diketahui dengan cara mengamati laju aliran semen pada dinding tabung. Aliran semen yang cepat digolongkan ke dalam konsistensi semen yang encer sedangkan aliran semen yang lambat digolongkan ke dalam konsistensi semen yang kental. Derajat keasaman (pH) semen diketahui dengan cara meneteskan semen di atas kertas indikator pH berskala 6.8 sampai 8.0. Perubahan warna pada kertas pH tersebut disesuaikan dengan standar perubahan warna yang menunjukkan nilai pH pada tabel.

Gerakan massa spermatozoa diketahui dengan cara membuat tetesan semen pada gelas obyek kemudian diamati di bawah mikroskop dengan pembesaran lensa obyektif 10X. Sedangkan persentase motilitas spermatozoa ditentukan melalui pengamatan spermatozoa di bawah mikroskop dengan pembesaran lensa obyektif 40X pada enam lapang pandang.  Penilaian yang diberikan mulai nol persen (tidak ada spermatozoa yang bergerak ke depan) sampai 100 persen (semua spermatozoa bergerak ke depan).

Perhitungan  konsentrasi spermatozoa dilakukan secara bersamaan dengan penentuan keutuhan membran plasma spermatozoa.  Hal ini dimungkinkan karena spermatozoa diencerkan dengan larutan yang dipakai untuk Hypo-Osmotic Swelling Test (HOS-Test) yaitu NaCl 0.032M dan tekanan osmotik 53-63 mOsmol/l. Metode ini merupakan modifikasi metode yang dikembangkan oleh Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia yang berasal dari Correa dan Zavos (1994). Sampel semen diencerkan 300 kali menggunakan larutan HOS dan dibiarkan selama lima menit pada suhu kamar. Untuk keperluan pengamatan, diteteskan 10 μl sampel semen pada gelas haemocytometer dan evaluasi dilakukan di bawah mikroskop dengan pembesaran lensa obyektif 10X. Perhitungan dilakukan pada lima kotak teracak terhadap spermatozoa yang mempunyai ekor melingkar (membran plasma utuh) maupun yang mempunyai ekor lurus (membran plasma tidak utuh). Jumlah total kedua jenis spermatozoa yang dihitung pada lima kotak teracak tersebut (Sh) merupakan faktor yang dipergunakan dalam mengestimasi konsentrasi spermatozoa yang menggunakan rumus (Hafez  1987):     KS = Sh x FM x P

Keterangan:     KS       = konsentrasi spermatozoa

                                    Sh        = jumlah spermatozoa yang terhitung pada haemocytometer

                                    FM      = faktor multiplikasi

                                    P          = pengenceran

Penentuan spermatozoa hidup dilakukan dengan menggunakan metode pewarnaan eosin. Sebanyak 10 μl sampel semen dan 10 μl  eosin B 2% dicampur di atas gelas obyek kemudian dibuat preparat ulas dan dibiarkan mengering sebelum dilakukan pengamatan di bawah mikroskop dengan pembesaran lensa obyektif 20X. Spermatozoa yang dikategorikan hidup adalah spermatozoa yang tidak menyerap zat warna sehingga pada bagian kepala spermatozoa tidak terwarnai (putih), sedangkan spermatozoa yang dikategorikan mati adalah spermatozoa yang menyerap zat warna sehingga pada bagian kepalanya akan berwarna merah. Persentase hidup spermatozoa ditentukan berdasarkan perbandingan antara jumlah spermatozoa hidup dengan jumlah total spermatozoa. Jumlah total spermatozoa yang yang dihitung adalah 200 spermatozoa.

Keutuhan tudung akrosom spermatozoa dievaluasi menggunakan larutan formal saline. Sebanyak 10 μl sampel semen dimasukkan ke dalam 1 ml larutan formal saline dan diinkubasi pada suhu kamar selama satu jam. Selanjutnya dilakukan pengamatan sebanyak 200 spermatozoa di bawah mikroskop dengan pembesaran lensa obyektif 20X. Spermatozoa yang memperlihatkan lingkaran tudung akrosom dikategorikan sebagai spermatozoa dengan tudung akrosom utuh, sebaliknya spermatozoa yang tidak memperlihatkan lingkaran tudung akrosom dikategorikan sebagai spermatozoa dengan tudung akrosom yang tidak utuh. Sedangkan pengamatan abnormalitas spermatozoa dilakukan terhadap spermatozoa yang mempunyai kelainan baik pada kepala maupun ekor spermatozoa, yang meliputi kepala besar atau kecil, berkepala dua atau berekor dua dan kondisi abnormal yang lain. Pengamatan di bawah mikroskop dengan pembesaran lensa obyektif 40X dilakukan pada 200 spermatozoa.

            Sediaan spermatozoa dalam bentuk kering diperoleh melalui penerapan metode pengeringbekuan yang diadopsi dari Kaneko et al. (2003) dengan sedikit modifikasi. Secara jelas dapat diuraikan sebagai berikut. Sejumlah 100 μl (2 x 109 spermatozoa/ml) semen domba dimasukkan ke dalam tube 1.5 ml kemudian ditambahkan medium pelarut EDTA, EGTA atau PBS dengan pH 8.0 sebanyak 1.3 ml. Selanjutnya campuran semen tersebut diinkubasi pada suhu 37oC selama 10 menit.  Fraksi spermatozoa yang berada di bagian atas tube diambil secara perlahan-lahan dan dipindahkan masing-masing sebanyak 100 μl ke dalam tube berpenutup ulir 1.5 ml  (Cryo-tube, Greiner). Tube tersebut selanjutnya dimasukkan ke dalam nitrogen cair hingga proses pengeringbekuan dimulai. Proses pengeringbekuan diawali dengan pemasangan tube ke alat pengeringbekuan, selanjutnya mesin dijalankan dan proses pengeringbekuan berjalan hingga terbentuk tepung spermatozoa di dalam tube tersebut. Tube selanjutnya dilepas dari mesin pengeringbekuan, ditutup rapat, divakum dengan menggunakan syringe 10 ml dan disimpan di dalam lemari es (3-5oC ) hingga digunakan.

Evaluasi terhadap perubahan morfologi spermatozoa dilakukan secara berkala yaitu, pada bulan ketiga, keenam dan kesembilan setelah pengeringbekuan dan penyimpanan di dalam lemari es (3-5oC ). Hasil evaluasi digolongkan ke dalam tiga kategori, yaitu spermatozoa utuh, spermatozoa dengan ekor abnormal dan spermatozoa dengan ekor putus (terpisah antara kepala dan ekor). Hasil perhitungan ini kemudian dibandingkan dengan morfologi spermatozoa segar berdasarkan ketiga kategori di atas.  Jumlah spermatozoa yang diamati pada setiap perlakuan adalah 300 spermatozoa.

Rancangan Percobaan dan Analisis Data

Penelitian ini dirancang dengan menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) pola faktorial 3 x 3 dengan tiga ulangan. Faktor pertama adalah jenis medium pelarut spermatozoa yang terdiri atas medium EDTA, EGTA dan PBS. Sedangkan faktor kedua adalah waktu pengeringbekuan spermatozoa di dalam mesin pengeringbekuan yang terdiri atas satu, dua dan tiga jam. Dengan demikian akan terdapat sembilan kombinasi perlakuan, yaitu medium EDTA dengan lama pengeringbekuan masing-masing satu jam (EDTA-1), dua jam (EDTA-2) dan tiga jam (EDTA-3) dan medium EGTA dengan lama pengeringbekuan masing-masing satu jam (EGTA-1), dua jam (EGTA-2) dan tiga jam (EGTA-3) serta medium PBS dengan lama pengeringbekuan masing-masing satu jam (PBS-1), dua jam (PBS-2) dan tiga jam (PBS-3).

Data perubahan morfologi spermatozoa hasil pengeringbekuan dianalisis menggunakan program SPSS versi 13 dengan taraf pengujian 5%. Hasil evaluasi semen segar disajikan dalam bentuk rata-rata dan standar deviasi.

 HASIL DAN PEMBAHASAN

 Evaluasi Semen Segar

             Evaluasi semen segar dilakukan untuk mengetahui kualitas semen dan spermatozoa domba pada awal penelitian sebelum diproses lebih lanjut. Evaluasi ini dibagi dalam dua kategori, yaitu evaluasi secara makroskopis dengan perhatian utama pada semen yang meliputi pengukuran volume, konsistensi, warna serta pH semen dan evaluasi secara mikroskopis dengan perhatian utama pada individu dan massa spermatozoa yang meliputi perhitungan konsentrasi, gerakan massa, persentase motilitas, persentase hidup, persentase membran plasma utuh dan persentase tudung akrosom utuh serta abnormalitas spermatozoa. Hasil evaluasi semen dan spermatozoa segar domba yang digunakan pada penelitian ini dapat dilihat pada Tabel 1.

Tabel 1  Hasil evaluasi semen segar domba penelitian

Variabel Nilai
Volume (ml/ejakulat) 0.67±0.19
Warna Putih – krem
Konsistensi Kental
pH 7.05±0.20
Konsentrasi (juta/ml) 3052.00±13.18
Gerakan massa ++(+)
Persentase motilitas (%) 77.33±2.58
Persentase membran plasma utuh (%) 83.33±0.94
Persentase tudung akrosom utuh (%) 83.83±1.61
Persentase hidup (%) 85.26±1.16
Abnormalitas (%) 6.33±0.82

 Volume Semen. Volume semen yang dihasilkan seekor pejantan domba dalam satu ejakulasi cukup bervariasi dan sangat tergantung dari umur, berat, status kesehatan dan reproduksi, kualitas makanan, frekuensi penampungan dan bangsa domba (Toelihere 1993). Domba yang digunakan pada penelitian ini adalah domba jantan lokal dengan kisaran umur tiga sampai empat tahun (berdasarkan pergantian gigi) dan bobot badan ±45 kg. Nilai rata-rata volume semen yang diperoleh pada domba tersebut adalah 0.67±0.19 ml. Hasil ini lebih rendah dari nilai rata-rata volume semen domba lokal Bogor (Toelihere 1993), yaitu 0.8-1.2 ml, tetapi lebih tinggi dibanding volume semen domba ekor gemuk di Jawa Timur 0.3-0.4 ml (Pamungkas et al. 1996).

Konsistensi dan Warna Semen serta Konsentrasi Spermatozoa. Konsistensi dan warna semen umumnya dijadikan indikator untuk memprediksi konsentrasi spermatozoa yang terdapat di dalam semen secara cepat. Pada keadaan yang normal dapat diasumsikan bahwa semen yang kental akan mengandung spermatozoa dengan konsentrasi yang tinggi. Semen domba yang digunakan pada penelitian ini mempunyai konsistensi yang kental dan berwarna putih sampai krem serta konsentrasi 3052.00±13.18 juta/ml. Inounu et al. (2001) melaporkan bahwa warna semen domba garut berkisar antara bening sampai krem dengan konsistensi encer hingga kental dan konsentrasi 950-4080 juta/ml. Sedangkan Feradis (1999) menyatakan bahwa semen domba st.Croix rata-rata berwarna krem dengan konsistensi yang kental dan konsentrasi 3785 juta/ml.

Derajat Keasaman (pH) Semen. Derajat keasaman (pH) semen merupakan salah satu faktor pembatas kelangsungan hidup spermatozoa di dalam semen.  Perubahan pH ke arah yang lebih asam (angka lebih kecil dari 7) akibat penimbunan asam laktat hasil metabolisme anaerob dapat menurunkan tingkat kelangsungan hidup spermatozoa (Toelihere 1993). Derajat keasaman semen domba yang diperoleh pada penelitian ini masih berkisar pada pH netral, yaitu pH 7.05±0.20. Toelihere (1993) melaporkan bahwa pH semen domba lokal Bogor berkisar 6.2-7.0, sedangkan Rizal (2005) melaporkan bahwa pH semen domba Garut berkisar antara 6.8-7.2.

Gerakan Massa dan Persentase Motilitas Spermatozoa.  Spermatozoa bergerak dalam kelompok (massa) yang menyerupai awan dengan pola yang bergelombang sehingga akan terlihat perubahan gelombang tebal dan tipis. Menurut Toelihere (1993), penilaian pergerakan massa spermatozoa dibagi ke dalam beberapa kategori, yaitu sangat baik (+++), baik (++), cukup (+) dan jelek (N, necrospermia atau O, oligospermia). Gerakan massa spermatozoa yang diperoleh pada penelitian ini berkisar antara baik (++) dan sangat baik (+++). Hal ini menunjukkan bahwa kecepatan pergerakan massa spermatozoa dapat dijadikan indikator untuk memprediksi motilitas individu spermatozoa. Sebagai pembanding dapat dikemukakan bahwa gerakan massa spermatozoa domba garut rata-rata 2.89 (berkisar antara 2 dan 3 pada skala 1-3) (Rizal 2005), sedangkan  Inounu et al. (2001) melaporkan bahwa nilai rata-rata gerakan massa spermatozoa domba Garut adalah 2.81 (berkisar antara 1 dan 4 pada skala 1-4).

Persentase motilitas spermatozoa merupakan salah satu indikator utama dalam proses evaluasi spermatozoa. Variabel ini sangat erat hubungannya dengan daya fertilisasi spermatozoa. Nilai rata-rata persentase motilitas spermatozoa domba yang digunakan pada penelitian ini adalah 77.33±2.58%. Nilai ini masih pada kisaran persentase motilitas spermatozoa yang layak digunakan untuk fertilisasi, baik secara in vivo maupun in vitro. Wuwuh (1990) melaporkan bahwa persentase motilitas spermatozoa domba Priangan berkisar 66-80% dan domba lokal Bogor rata-rata 75% (Toelihere 1993).  Sedangkan Rizal (2005) melaporkan bahwa persentase motilitas domba Garut rata-rata 77.07%.

Keutuhan Membran Plasma dan Akrosom. Keutuhan membran plasma bagi spermatozoa mutlak diperlukan untuk memenuhi fungsinya sebagai pelindung organel di dalam sel dan penyaring bagi pertukaran zat intraseluler dan ekstraseluler. Demikian halnya dengan kondisi tudung akrosom yang harus tetap utuh untuk menjaga keamanan enzim-enzim fertilisasi yang terdapat di dalam vesikel akrosom. Untuk mengamati keutuhan membran plasma spermatozoa digunakan larutan  NaCl 0.032M dengan tekanan osmotik 53-63 mOsmol/l. Tekanan osmotik sel mamalia termasuk sel spermatozoa rata-rata 300 mOsmol/l, sehingga spermatozoa dengan membran plasma utuh yang dipapar pada cairan hipoosmotik tersebut akan mengalami penggembungan (swollen) akibat difusi air dari luar ke dalam sel dan ekor spermatozoa akan melingkar (Gambar 1a). Hal ini tidak muncul pada spermatozoa yang membran plasmanya tidak utuh lagi (Gambar 1b).

Nilai rata-rata keutuhan membran plasma spermatozoa semen segar yang diperoleh pada penelitian ini adalah 83.33±0.94%, sedangkan nilai rata-rata keutuhan tudung akrosomnya adalah 83.83±1.61%. Kedua nilai tersebut masih pada kisaran nilai normal untuk variabel yang dimaksud jika dihubungkan dengan kemampuan fertilisasi seperti yang dikemukakan oleh Revell dan Mrode (1994) bahwa nilai persentase keutuhan membran plasma yang kurang dari 60% dikategorikan sebagai spermatozoa yang infertil.

10μm

 

 Gambar 1  Spermatozoa dengan membran plasma utuh (ekor melingkar, a) dan spermatozoa dengan membran plasma tidak utuh (ekor lurus, b)

Persentase Spermatozoa Hidup dan Abnormalitas Spermatozoa.  Pemeriksaan fungsi membran untuk menentukan persentase hidup spermatozoa juga dapat dilakukan dengan menggunakan pewarna eosin B yang dicampur dengan ion sodium. Spermatozoa yang hidup masih mempunyai sistem membran yang berfungsi termasuk fungsi pengaturan ion terutama ion sodium. Hal ini akan menyebabkan penahanan difusi medium pewarna (eosin B) yang mengandung ion sodium oleh sistem membran pada saat pemaparan spermatozoa ke dalam medium pewarna. Akibatnya spermatozoa tidak akan terwarnai oleh pewarna eosin B (Gambar 2a). Sebaliknya pada spermatozoa mati, sistem membrannya telah rusak sehingga dengan mudah dapat dilewati eosin B dan spermatozoa akan berwarna merah (Gambar 2b).

Abnormalitas spermatozoa merupakan salah satu faktor yang menjadi pertimbangan dalam menilai kelayakan semen yang digunakan pada inseminasi buatan. Toelihere (1993) mengatakan bahwa semen domba yang baik apabila mempunyai persentase abnormalitas kurang dari 14%. Sedangkan Hafez dan Hafez (2000) menetapkan nilai abormalitas pada kisaran 5-20%. Nilai rata-rata persentase abnormalitas spermatozoa yang diperoleh pada penelitian ini sebesar 6.33±0.82. Nilai ini masih berada pada kisaran nilai abnormalitas spermatozoa yang memenuhi syarat untuk diproses lebih lanjut.

10μm

 

 Gambar 2  Spermatozoa hidup dengan kepala berwarna putih (a) dan spermatozoa mati dengan kepala berwarna merah (b)

Evaluasi Perubahan Morfologi Spermatozoa setelah Pengeringbekuan.

Evaluasi perubahan morfologi spermatozoa dilakukan secara bertahap, yaitu pada bulan ketiga, keenam dan kesembilan setelah proses pengeringbekuan. Perubahan morfologi yang berhubungan dengan keutuhan spermatozoa dibagi tiga kategori, yaitu spermatozoa utuh, spermatozoa dengan ekor abnormal dan spermatozoa dengan ekor putus (terpisah antara kepala dan ekor) (Gambar3).

 

 Gambar 3  Spermatozoa utuh (a), spermatozoa dengan ekor abnormal (b) dan spermatozoa dengan ekor putus (c)

Hasil evaluasi terhadap perubahan morfologi spermatozoa berdasarkan lama penyimpanan setelah pengeringbekuan dapat dilihat berturut-turut pada Tabel 2, 3 dan 4.

 Tabel 2  Perubahan morfologi spermatozoa hasil pengeringbekuan setelah disimpan 3 bulan pada suhu 3-5oC

Perlakuan Perubahan morfologi (%) Total (%)
Utuh Ekor abnormal Ekor putus
EDTA-1 30(10) 255(85)ac 15(5)bd 300(100)
EDTA-2 21(7) 249(83)ac 30(10)ac 300(100)
EDTA-3 24(8) 240(80)bc 36(12)a 300(100)
EGTA-1 18(6) 261(87)a 21(7)bc 300(100)
EGTA-2 24(8) 261(87)a 15(5)bd 300(100)
EGTA-3 27(9) 258(86)ac 15(5)bd 300(100)
PBS-1 21(7) 261(87)a 18(6)bc 300(100)
PBS-2 24(8) 252(84)ac 24(8)acd 300(100)
PBS-3 24(8) 249(83)ac 27(9)acd 300(100)
Total 213(7.9) 2286(84.7) 201(7.4) 2700(100)

Huruf yang berbeda pada kolom yang sama menunjukkan perbedaan yang nyata pada taraf uji 5%

 Tabel 3  Perubahan morfologi spermatozoa hasil pengeringbekuan setelah disimpan 6 bulan pada suhu 3-5oC

Perlakuan Perubahan morfologi (%) Total (%)
Utuh Ekor abnormal Ekor putus
EDTA-1 30(10)a 246(82)ac 24(8)bde 300(100)
EDTA-2 18(6)ac 243(81)bc 39(13)ac 300(100)
EDTA-3 18(6)ac 246(82)ac 36(12)acd 300(100)
EGTA-1 18(6)ac 258(86)ac 24(8)bde 300(100)
EGTA-2 24(8)ac 258(86)ac 18(6)be 300(100)
EGTA-3 24(8)ac 261(87)a 15(5)b 300(100)
PBS-1 15(5)bc 255(85)ac 30(10)ace 300(100)
PBS-2 15(5)bc 243(81)bc 42(14)a 300(100)
PBS-3 18(6)ac 246(82)ac 36(12)acd 300(100)
Total 180(6.7) 2256(83.6) 264(9.8) 2700(100)

Huruf yang berbeda pada kolom yang sama menunjukkan perbedaan yang nyata pada taraf uji 5%

Nilai rata-rata persentase tertinggi spermatozoa hasil pengeringbekuan yang masih utuh setelah disimpan tiga bulan pada suhu 3-5oC diperoleh pada perlakuan EDTA-1 (10%) dan EGTA-3 (9%) tetapi tidak berbeda nyata (P>0.05) dengan perlakuan yang lain. Pada penyimpanan enam bulan, nilai rata-rata persentase tertinggi spermatozoa hasil pengeringbekuan yang utuh diperoleh pada perlakuan EDTA-1 (10%) yang berbeda nyata (P<0.05) dengan perlakuan PBS-1 (5%) dan PBS-2 (5%) tetapi tidak berbeda nyata (P>0.05) dengan perlakuan EDTA-2 (6%), EDTA-3 (6%), EGTA-1 (6%), EGTA-2 (8%), EGTA-3 (8%) dan PBS-3 (6%). Demikian halnya dengan penyimpanan 9 bulan, nilai rata-rata persentase tertinggi spermatozoa hasil pengeringbekuan yang utuh diperoleh pada perlakuan EDTA-1 (9%) dan EGTA-3 (8%) yang berbeda nyata (P<0.05) dengan perlakuan PBS-1 (4%), PBS-2 (4%) dan PBS-3 (4%) tetapi tidak berbeda nyata (P>0.05) dengan perlakuan EDTA-2 (5%), EDTA-3 (5%), EGTA-1 (6%) dan EGTA-2 (7%).

Untuk kategori spermatozoa hasil pengeringbekuan dengan ekor abnormal setelah disimpan tiga bulan pada suhu 3-5oC, nilai rata-rata persentase terendah diperoleh pada perlakuan EDTA-3 (80%) yang berbeda nyata (P<0.05) dengan perlakuan EGTA-1 (87%), EGTA-2 (87%) dan PBS-1 (87%), tetapi tidak berbeda nyata (P>0.05) dengan perlakuan EDTA-1 (85%), EDTA-2 (83%), EGTA-3 (86%), PBS-2 (84%) dan PBS-3 (83%). Pada penyimpanan 6 bulan, rata-rata persentase terendah spermatozoa hasil pengeringbekuan dengan ekor abnormal diperoleh pada perlakuan EDTA-2 (81%) dan perlakuan PBS-2 (81%) yang berbeda nyata (P<0.05) dengan perlakuan EGTA-3 (87%), tetapi tidak berbeda nyata (P>0.05) dengan perlakuan yang lain. Sedangkan pada penyimpanan 9 bulan, rata-rata persentase terendah spermatozoa hasil pengeringbekuan dengan ekor abnormal diperoleh pada perlakuan EDTA-1 (81%), EDTA-2 (81%) dan PBS-2 (81%) yang berbeda nyata (P<0.05) dengan perlakuan EGTA-2, tetapi tidak berbeda nyata (P>0.05) dengan perlakuan EDTA-3 (82%), EGTA-1 (85%), EGTA-3 (86%), PBS-1 (84%) dan PBS-3 (82%).

Tabel 4  Perubahan morfologi spermatozoa hasil pengeringbekuan setelah disimpan 9 bulan pada suhu 3-5oC

Perlakuan Perubahan morfologi (%) Total (%)
Utuh Ekor abnormal Ekor putus
EDTA-1 27(9)a 243(81)bc 30(10)ad 300(100)
EDTA-2 15(5)ac 243(81)bc 42(14)ac 300(100)
EDTA-3 15(5)ac 246(82)ac 39(13)ac 300(100)
EGTA-1 18(6)ac 255(85)ac 27(9)bc 300(100)
EGTA-2 21(7)ac 261(87)a 18(6)bd 300(100)
EGTA-3 24(8)a 258(86)ac 18(6)bd 300(100)
PBS-1 12(4)bc 252(84)ac 36(12)ac 300(100)
PBS-2 12(4)bc 243(81)bc 45(15)a 300(100)
PBS-3 12(4)bc 246(82)ac 42(14)ac 300(100)
Total 156(5.8) 2247(83.2) 297(11) 2700(100)

Huruf yang berbeda pada kolom yang sama menunjukkan perbedaan yang nyata pada taraf uji 5%

 Sedangkan untuk kategori spermatozoa hasil pengeringbekuan dengan ekor putus setelah disimpan selama tiga bulan pada suhu 3-5oC, nilai rata-rata persentase terendah diperoleh pada perlakuan EGTA-2 (5%), EGTA-3 (5%) dan EDTA- 1 (5%) yang berbeda nyata (P<0.05%) dengan perlakuan EDTA-2 (10%) dan EDTA-3 (12%). Pada penyimpanan selama 6 bulan nilai rata-rata persentase terendah diperoleh pada perlakuan EGTA-3 (5%) yang berbeda nyata dengan perlakuan EDTA-2 (13%), EDTA-3 (12%), PBS-1 (10%), PBS-2 (14%) dan PBS-3 (12%). Pada  penyimpanan sembilan bulan, nilai rata-rata persentase terendah spermatozoa hasil pengeringbekuan dengan ekor putus diperoleh pada perlakuan EGTA-2 (6%) dan EGTA-3 (6%) yang berbeda nyata (P<0.05) dengan semua perlakuan kecuali perlakuan EGTA-1 (9%). Bahkan nilai terbesar didapatkan pada perlakuan PBS-2 (15%) yang berbeda nyata (P<0.05) dengan semua perlakuan EGTA baik satu, dua maupun tiga jam.

 

Gambar 4  Persentase perubahan morfologi spermatozoa hasil pengeringbekuan pada semua perlakuan setelah disimpan selama 3, 6 dan 9 bulan pada suhu 3-5oC

Berdasarkan kategori yang ditetapkan dapat diketahui bahwa nilai rata-rata persentase spermatozoa hasil pengeringbekuan dengan ekor abnormal pada semua perlakuan sangat mendominasi baik pada masa penyimpanan tiga bulan (84.7%), enam bulan (83.6%) maupun sembilan bulan (83.2%) dibandingkan spermatozoa hasil pengeringbekuan dengan ekor putus masing-masing 7.4% (tiga bulan), 9.8% (enam bulan) dan 11% (sembilan bulan) serta spermatozoa hasil pengeringbekuan yang utuh 7.9% (tiga bulan), 6.7% (enam bulan) dan 5.8% (sembilan bulan). Hasil ini berbeda nyata (P<0.05) dengan morfologi spermatozoa segar dengan nilai rata-rata persentase spermatozoa utuh yang mendominasi (95%) diikuti spermatozoa dengan ekor abnormal (4%) dan spermatozoa dengan ekor putus (1%) (Gambar 4).  

Hal ini menunjukkan bahwa selama proses pengeringbekuan baik pada tahap pembekuan di dalam nitrogen cair maupun pada tahap sublimasi di dalam mesin pengeringbekuan terjadi perubahan kondisi ekstrim yang menyebabkan bagian  ekor  spermatozoa  menjadi rapuh sehingga mudah terpotong atau berubah bentuk menjadi abnormal. Kaneko et al. (2003) menyatakan bahwa proses pengeringbekuan akan merusak komponen struktural spermatozoa.  Selain itu juga terjadi pemisahan kepala dan ekor spermatozoa. Namun demikian, beberapa penelitian menunjukkan bahwa kondisi ekor spermatozoa dan membran plasma yang utuh tidak diperlukan pada metode fertilisasi ICSI (Ward et al. 2003; Said et al. 2003). Ekor spermatozoa yang utuh hanya dibutuhkan pada metode fertilisasi in vitro konvensional untuk membantu pergerakan spermatozoa melakukan fertilisasi, sedangkan membran plasma dan akrosom spermatozoa dibutuhkan untuk melindungi enzim-enzim fertilisasi sebelum digunakan.

Kesimpulan

            Berdasarkan hasil penelitian dapat disimpulkan bahwa:

  1. Spermatozoa hasil pengeringbekuan mengalami kerusakan membran plasma dan akrosom yang dibuktikan melalui teknik pewarnaan dan bagian ekor spermatozoa sebagian besar mengalami perubahan setelah pengeringbekuan.
  2. Perubahan morfologi spermatozoa banyak terjadi pada saat pengeringbekuan, sedangkan pada saat penyimpanan pada lemari es (3-5oC) morfologi spermatozoa cenderung stabil.

Daftar Pustaka

Bag S, Joshi A, Naqvi SMK, Rawat PS, Mittal JP.  2002.  Effect of freezing temperature, at which straw were plunged into liquid nitrogen, on the post-thaw motility and acrosomal status of ram spermatozoa.  Anim Reprod Sci  72:175-183. 

Correa JR, Zavos PM.  1994.  The hypoosmotic swelling test: Its employment as an assay to evaluate the functional integrity of the frozen-thawed bovine sperm membrane.  Theriogenology  42:351-360.

Feradis.  1999. Penggunaan Antioksidan dalam Pengencer Semen Beku dan Metode Sinkronisasi Estrus pada Program Inseminasi Buatan Domba St. Croix. Disertasi. Bogor: Program Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor.

Hafez ESE. 1987. Reproduction in Farm Animals. 5th edition. Lea and Febiger, Philadelphia.

Hafez ESE, Hafez B. 2000. Reproduction in Farm Animals. 7th edition. Baltimore: Lippincott Williams & Wilkins.

Hoshi K, Yanagida K, Katayose H, Yazawa H. 1994.  Pronuclear formation and cleavage of mammalian eggs after microsurgical injection of freeze-dried sperm nuclei. Zygote 2:237-242.

Inounu I, Hidajati N, Jarmani SN, Priyanto D, Hastono SB, Subandriyo. 2001.  Pengaruh interaksi genetik dan lingkungan terhadap produksi domba persilangan dan domba lokal pada beberapa lokasi pengamatan:evaluasi kualitas semen domba hasil persilangan. Di dalam Prosiding Seminar Hasil Penelitian Bagian “Proyek Rekayasa Teknologi Peternakan/ARMP II”. Pusat Penelitian dan Pngembangan Peternakan, Bogor. hlm 64-73.

Kaneko T, Whittingham DG, Yanagimachi R.  2003.  Effect of pH value of freeze-drying solution on the chromosome integrity and developmental ability of mouse spermatozoa. Biol Reprod  68:136-139.

Keskintepe L et al. 2002. Bovine blastocyst development from oocytes injected with freeze-dried spermatozoa. Biol Reprod  67:409-415.

Kwon IK, Park KE, Niwa K. 2004. Activation, pronuclear formation, and development in vitro of pig oocytes following intracytoplasmic injection of freeze-dried spermatozoa. Biol Reprod  71:1430-1436.

Liu JL et al. 2004. Freeze-dried sperm fertilization leads to full-term development in rabbits.  Biol Reprod  70:1776-81.

Pamungkas D, Affandhy L, Umiyasih U. 1996.  Pertumbuhan, libido dan kualitas semen domba ekor gemuk yang diberi pakan dengan kandungan gizi yang berbeda.  Di dalam Prosiding Seminar Nasional Peternakan dan Veteriner. Pusat Penelitian dan Pengembangan Peternakan, Cisarua, Bogor 7-8 Nopember 1995. hlm 495-464.

Pangestu M, Lewin L, Shaw J, Lacham-Kaplan O, Trounson A. 2001.  Evaluation of embryo development after ICSI with dried mouse spermatozoa. Theriogenology 55:508 (Abstract).

Revell SG, Mrode RA.  1994.  An osmotic resistance test for bovine semen. Anim Reprod Sci 36:77-86.

Rizal Amin M. 2005. Fertilitas Spermatozoa Ejakulat dan Epididimis Domba Garut Hasil Kriopreservasi Menggunakan Modifikasi Pengencer Tris dengan Berbagai Krioprotektan dan Antioksidan. Disertasi. Bogor: Sekolah Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor.

Said S, Saili T, Tappa B. 2003.  Pengaktifan dan pembuahan sel telur tikus setelah disuntik dengan kepala spermatozoa.  Hayati 10:96-99

Toelihere MR. 1993.  Inseminasi Buatan pada Ternak. Bandung:Angkasa.

Ward MA et al. 2003. Long-term preservation of mouse spermatozoa after freeze-drying and freezing without cryoprotection. Biol Reprod 69:2100-2108.

Weitze KF, Petzoldt R.  1992.  Preservation of semen.  Anim Reprod Sci  28:229-235.

Wuwuh MIS. 1990.  Telaah Kualitas Semen Domba Priangan dan Silangan Suffolk-Priangan serta Upaya Inseminasi Buatan dan Superovulasi. Disertasi. Bogor: Program Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor.

THE ABILITY OF RAT CAUDA EPIDIDYMAL SPERMATOZOA CRYOPRESERVED WITHOUT CRYOPROTECTANT IN LIQUID NITROGEN TO INDUCE PRONUCLEUS FORMATION

February 3, 2010

THE ABILITY OF RAT CAUDA EPIDIDYMAL SPERMATOZOA CRYOPRESERVED WITHOUT CRYOPROTECTANT IN LIQUID NITROGEN TO INDUCE PRONUCLEUS FORMATION

(Kemampuan Spermatozoa Cauda Epididymis Tikus yang Dikriopreservasi tanpa Krioprotektan di dalam Nitrogen Cair Guna Merangsang Pembentukan Pronukleus)

Takdir Saili1 and Syahruddin Said2

1Faculty of Agriculture, Haluoleo University, Kampus Bumi Tri Dharma Anduonohu, Kendari

2Research Center for Biotechnology, Indonesian Institute of Sciences (LIPI), Jalan Raya Bogor Km 46, Cibinong

 ABSTRACT

 In the present study we have evaluated the ability of rat cauda epididymal spermatozoa cryopreserved without cryoprotectant in liquid nitrogen (-196°C) to induce pronucleus formation by using ICSI method. The results showed that 45% and 64% oocytes were success ICSI when injected by freeze-thawed spermatozoa and fresh sperm, respectively, while the rests were fail to be activated after 10 hours of culture in modified Krebs-Ringer-Bicarbonate medium (mKRB) at 5% CO2 incubator, and 37°C.   By using lacmoid staining, it is revealed that among the success ICSI oocytes, 37% and 69% oocytes were activated when injected by freeze-thawed spermatozoa and fresh spermatozoa, respectively. Moreover, among activated oocytes injected by freeze-thawed spermatozoa showed 11% oocytes having two pronucleus, 8% oocytes having decondensed spermatozoa and 18% oocytes having condensed spermatozoa. Whereas 14% oocytes having condensed spermatozoa, 28% oocytes having decondensed spermatozoa and 27% oocytes having two pronucleus were gained when activated oocytes were injected by fresh spermatozoa. Based on the results it was concluded that injection of oocytes with rat cauda epididymal spermatozoa cryopreserved without cryoprotectant in liquid nitrogen could develop injected oocytes to formation of male and female pronucleus.

 Keywords : ICSI, rat cauda epididymal spermatozoa, pronucleus.

ABSTRAK

Pada penelitian ini kami mengevaluasi kemampuan spermatozoa cauda epididymis yang dibekukan tanpa krioprotektan di dalam nitrogen cair (-196°C) untuk mendukung pembentukan pronukleus jantan dan betina pada sel telur tikus melalui metode mikrofertilisasi ICSI. Hasil penelitian menunjukkan bahwa sejumlah 45% dan 64% sel telur mempunyai bentuk yang normal (sukses ICSI) setelah diinjeksi menggunakan masing-masing spermatozoa beku dan segar yang selanjutnya dikultur pada medium mKRB di dalam inkubator CO2 5%, 37°C selama 10 jam. Melalui pewarnaan aceto lacmoid diperoleh hasil bahwa terdapat 37% dan 69% sel telur yang sukses ICSI berhasil teraktivasi setelah diinjeksi masing-masing dengan spermatozoa beku dan segar. Di antara sel telur yang teraktivasi setelah diinjeksi dengan spermatozoa beku, terdapat 11% sel telur  memiliki dua pronukleus, 8% sel telur memilki decondensed spermatozoa dan 18% sel telur memiliki condensed spermatozoa. Sedangkan di antara sel telur yang teraktivasi setelah diinjeksi dengan spermatozoa segar terdapat 27% sel telur  memiliki dua pronukleus, 28% sel telur memiliki decondensed spermatozoa dan 14% sel telur memiliki condensed spermatozoa. Berdasarkan hasil yang diperoleh dapat disimpulkan bahwa injeksi sel telur menggunakan spermatozoa cauda epididymis yang dikriopreservasi tanpa krioprotektan di dalam nitrogen cair dapat mendukung pembentukan pronukleus jantan dan betina pada tikus.

Kata kunci : ICSI, spermatozoa cauda epididymis tikus, pronukleus

 INTRODUCTION

Development of various techniques for assisted reproduction including in vitro maturation (IVM) of oocytes, in vitro fertilization (IVF) of oocytes and in vitro culture (IVC) of embryos could play an important role in managing captive and natural populations of animals as well as in sustaining both genetic and global biodiversity (Wildt et al., 1992). The use of spermatozoa regardless of their motility for IVF may provide an approach for rescuing genetic materials from animals that died or underwent a vasectomy because of medical reasons. If the spermatozoa motility is not necessary for completing fertilization in ICSI assisted fertilization, it may be possible to use frozen-thawed spermatozoa without cryoprotectant to fertilize oocytes.

In the original study of ICSI in mammalian oocytes, Uehara and Yanagimachi (1976) showed that human spermatozoa frozen in isotonic solution without cryoprotectant can decondense and form pronuclei when injected into hamster oocyte, indicating that the spermatozoa nuclei is an extremely stable organelle. Furthermore, the genetic integrity of mouse spermatozoa and isolated spermatozoa heads was shown to be maintained after freezing and thawing in media containing glycerol. Normal offsprings were obtained after transfer of mouse oocytes fertilized by ICSI with such spermatozoa or spermatozoa heads (Kuretake et al., 1996). Normal mouse offsprings have also been obtained from oocytes microinjected with spermatozoa frozen in the absence of cryoprotectant (Wakayama et al., 1998).

In the present study we examined the ability of rat cauda epididymal spermatozoa cryopreserved without cryoprotectant in liquid nitrogen to induce pronucleus formation.

 MATERIALS AND METHODS

Cryopreservation of Cauda Epididymal Spermatozoa

Cauda epididymal spermatozoa were isolated from adult (four to eight months old) Wistar rats. A small part of cauda epididymides tract was excised with a fine scissors and a small drop of spermatozoa mass was placed in one milliliter milli-Q water in a 1.5-ml tapered centrifuge tube and vortexing for about 30 seconds and each 100-ml aliquot was transferred to another 1.5-ml tapered centrifuge tube. The swim-up method was performed to get the motile spermatozoa for 10 minutes in 37oC. The semen was then diluted using Hepes-modified Krebs-Ringer-Bicarbonate (Hepes-mKRB ) medium to reach the concentration of 200 x 106 cell/ml prior to loading in 0.5 ml straw. The straw was then heated-sealed and directly plunged into liquid nitrogen (-196°C) and stored in this temperature for up to one month.

Preparation of Oocytes

Adult (eight to 12 weeks old) female Wistar rats were induced to superovulate by i.p. injections of 25-30 IU eCG between 19:50 and 20:00 PM on the day of estrus and 25-30 IU hCG 48 hours later. The females were killed 13 hours after hCG injection and the excised oviducts were placed in a small drop (100-200 ml) of Hepes-mKRB supplemented with 0.1% (w/v) hyaluronidase from bovine testes (Sigma) in a polystyrene culture dish (35 x 10 mm; Falcon No. 1008, Becton Dickinson Labware, Lincoln Park, NJ) at 37°C. Oocytes with cumulus cells were released from the ampullar portion of the oviducts and kept in the medium for about five minutes. The cumulus-free oocytes were washed three times in Hepes-free mKRB containing 25.07 mM of NaHCO3, placed into 100 ml of the same medium, and kept in a CO2 incubator (5% CO2 in air at 37°C) for an hour until spermatozoa were microinjected.

 Preparation of Spermatozoa Heads

The straw containing spermatozoa were taken out from liquid nitrogen container and placed in water at 37°C for about one minute for thawing. Semen was then released from straw and placed into tube for performing sonication (ten 0.3 sec bursts at 0.7 sec interval) using a 20% power output of a Branson Sonifier Model 250 (Branson Ultrasonies, Danbury, CT) for three seconds. Separation into heads and tails was successful in more than 80%. A portion (100 ml) of the sonicated suspension was transferred into another centrifuge tube containing one milliliter Hepes-mKRB and the diluted spermatozoa suspension was centrifuged at 800 g for three minutes. The pelleted material consisting of spermatozoa heads and flagella was resuspended in one milliliter Hepes-mKRB.

Microinjection of Spermatozoa Heads

The oocytes which had been kept in a CO2 incubator were initially transferred into 100-200 ml mKRB-Hepes containing 5 mg/ml cytochalasin B to prevent spontaneous activation which occurs in rat oocytes at a high rate (Keefer and Schuetz, 1982). Then five microliters medium containing 8-10 oocytes was placed in a cover of a petri dish (50 x 4 mm; Falcon No. 1006, Becton Dickinson Labware, Lincoln Park, NJ) and covered with paraffin oil (Nacalai Tesque Inc., Kyoto, Japan). A small drop (one microliter) of the suspension containing 20-40 spermatozoa heads and some tails was introduced into a drop containing oocytes. Microinjection of spermatozoa head into oocyte was performed at 37°C using a piezo-driven pipette that was prepared from Borosilicate glass capillary tubes (Sutter Instrument Co., Novato, CA). The external diameter of the pipette tip was 4-5 mm. A spermatozoa head was aspirated into the injection pipette so that the apex of spermatozoa head was positioned facing the opening of the pipette. The pipette tip was brought in contact with the zona pellucida of the oocyte which was held by a holding pipette. The external diameter of holding pipette was 100-110 mm while its internal opening diameter was 15-20 mm. The zona was drilled by applying a few piezo pulses. The pipette tip was then introduced into the perivitelline space and forced slightly into the oolemma prior to application of a few piezo pulses in order to puncture the oolemma. The spermatozoa head, in a minimal amount of medium that did dot contain polyvinylpyrrolidone (PVP) was expelled into the ooplasm. The injection of spermatozoa head into oocyte was completed within one hour after sonication of spermatozoa. 

Determination of Oocyte Activation after ICSI

Spermatozoa heads isolated from spermatozoa were injected into oocytes. The injected oocytes were washed four times with Hepes-free mKRB containing 25.07 mM NaHCO3. Oocytes were then transferred into 100 ml of the same medium covered with paraffin oil in a culture dish (35 x 10 mm; Falcon No. 1008) and cultured in a CO2 incubator (5% CO2 in air at 37°C). At 10 hours after the start of culture, with morphologically normal oocytes were scored and grouped as ICSI-successed oocytes, while the rest were grouped as ICSI-failed oocytes. These ICSI-successed oocytes were then mounted, fixed with 2.5% (v/v) glutaraldehyde in phosphate buffer (pH 7.4) followed by 10% (v/v) neutral formalin and stained with 0.25% (w/v) lacmoid in 45% (v/v) acetic acid (Toyoda and Chang, 1974). The stained oocytes were examined for signs of oocyte activation and morphological changes of the penetrated spermatozoa head under a phase-contrast microscope. The activated oocytes showed different appearances based on the formation both of female and male pronucleus or changes in spermatozoa morphology determined by decondensation of spermatozoa nuclei. Whereas unactivated oocytes were indicated by the present of spermatozoa head without any changes (condensed sperm head) and without female pronucleus formation.

 Statistical analysis

All data were provided in mean and were analyzed for significant differences between treatments using X2-test.

RESULTS AND DISCUSSION

As shown in Table 1, when oocytes were injected with frozen-thawed spermatozoa heads 45% oocytes were success ICSI and 55% oocytes were fail ICSI. The results were significantly (P<0.05) lower than oocytes injected with fresh spermatozoa head in which 64% oocytes were success ICSI and only 36% oocytes were fail ICSI after 10 hours of culture in mKRB medium at 5% CO2 incubator, and 37°C.  Among success ICSI oocytes, there were  37% oocytes were activated after injection using frozen-thawed spermatozoa heads which is significantly difference (P<0.01) from oocytes injected by fresh spermatozoa head in which 69% oocytes were activated.  By using lacmoid staining, it is revealed that among activated oocytes injected by frozen-thawed spermatozoa heads, there were 11% oocytes with 2 pronucleus, 8% oocytes with decondensed spermatozoa, and 18% oocytes with condensed spermatozoa. The results were significantly (P<0.01) lower than oocytes injected by fresh spermatozoa head in which  27% oocytes having 2 pronucleus and 28 oocytes having decondensed spermatozoa, except for oocytes having condensed spermatozoa (14%) (Figure 1).

It has been shown that bovine spermatozoa remain alive and are functional even after cryopreservation in LN2 for up to 37 years (Leibo et al., 1994). In the mouse, successful cryopreservation of spermatozoa using raffinose plus skim milk (Okuyama et al., 1990) or glycerol (Tada et al., 1990) has been reported. Nakatsukasa et al. (2001) have recently obtained live rat offspring after intrauterine insemination with epididymal spermatozoa cryopreserved at -196°C with various concentrations of glycerol. In the rat, however, IVF using cryopreserved spermatozoa is extremely difficult. Using the technique of ICSI, it is demonstrated that spermatozoa that lost their motility after freezing and even only spermatozoa heads isolated from spermatozoa can contribute to normal fertilization, when they were microinjected into oocytes, leading to development to offspring (Kuretake et al., 1996; Wakayama et al., 1998). These results indicate that spermatozoa nuclei are extremely stable and their genetic integrity is completely maintained under freezing temperatures.

Table 1. Successful ICSI using fresh and frozen-thawed spermatozoa head in rat oocytes

Spermatozoa sources No.of oocytes injected No.of oocytes success ICSI (%)* No.of oocytes fail ICSI   (%)* No.of oocytes activated (%)** No.of oocytes not activated (%)**
Fresh (control) 111 71 (64)a 40 (36)a 49 (69)c 22 (31)c
Freeze-thawed1 84 38 (45)b 46 (55)b 14 (37)d 24 (63)d

 1Cauda epididimal spermatozoa stored for up to one month.

* Percentage of oocytes injected.

** Percentage of success ICSI.

CS = condensed spermatozoa

DS = decondensed spermatozoa

2PN = two pronucleus

a&b significantly difference at P<0.05

c&d significantly difference at P<0.01

Table 2.  Rat oocytes activation after ICSI using fresh and frozen-thawed spermatozoa head

Spermatozoa sources No.of oocytes success ICSI No.of oocytes activated with No.of oocytes not activated (%)
CS (%) DS (%) 2PN (%) Total (%)
Fresh (control) 71 10 (14) 20 (28) c 19 (27) c 49 (69) c 22 (31) c
Freeze-thawed 38 7 (18) 3 (8) d 4 (11) d 14 (37) d 24 (63) d

 

In the present study, we demonstrated that rat cauda epididymal spermatozoa cryopreserved in liquid nitrogen without cryoprotectant was able to activate oocytes to form female pronuclei (37%). Moreover, the interaction between oocytes and spermatozoa prior to the unity of both pronucleus were present in considerable number (19%) indicated by decondensation of spermatozoa head and formation of two pronucleus. Parrington et al. (1996) reported that chemical substance carried by spermatozoa which promoted activation in oocytes is called sperm-borne oocytes activating factor (SOAF). This protein which is then called oscillin have 33 kDa molecular weight and located in equatorial segment of spermatozoa acrosome. Oocytes activation may cause resumption of second meiosis indicated by the extrusion of second polar body and formation of female pronuclei. Subsequently, intracellular glutathione (GSH) mobilization and cytoplasmic proteins activation occured simultaneously in which GSH may cause decondensation of spermatozoa, a prerequisite event of male pronucleus formation, and one of the cytoplasmic protein called tubulin may play a role in the unity of male and female pronucleus. Perreault et al. (1988) stated that in order that spermatozoa DNA can participate in embryonic development, it must be unpackaged in the oocyte early in the process of fertilization. An initial event of the unpackaging process is a reduction in the protamine disulfide bonds that have been formed during epididymal maturation. The results explained that the nuclei of spermatozoa are fairly resistant even exposed to liquid nitrogen without cryoprotectant.  Yanagida et al. (1991) examined the thermostability of mammalian spermatozoa nuclei and reported that mammalian spermatozoa nuclei do not loss their ability to form pronuclei or to synthesize DNA even when exposed to high temperature (90°C for 30 minutes).

Figure 1.  Different stages of rat oocytes development following Intracytoplasmic Sperm Injection.

          A                        B                          C                   D
 
A= Oocyte with male and female pronucleus
B= Oocyte with female pronucleus and decondensed spermC= Oocyte with female pronucleus and condensed spermD= Oocyte without any pronucleus and condensed sperm

CONCLUSION

In conclusion, the present study indicates that separated spermatozoa head resulted from frozen-thawed rat cauda epididymal spermatozoa cryopreserved without cryoprectants was able to induce pronucleus formation.  

REFERENCES

Keefer CL and Schuetz AW.  1982.  Spontaneous activation of ovulated rat oocytes during in vitro culture. J Exp Zool., 224:371-377.

Kuretake S, Kimura Y, Hoshi K. and Yanagimachi R. 1996. Fertilization and development of mouse oocytes injected with isolated sperm heads. Biol Reprod, 55:789-795.

Leibo SP, Semple E. and Kroetsch TG. 1994. In vitro fertilization of oocytes by 37-year-old cryopreserved bovine spermatozoa. Theriogenology, 42:1257-1262.

Nakatsukasa E, Inomata T, Ikeda T, Shino M. and Kashiwazaki N. 200l. Generation of live offspring by intrauterine insemination with epididymal spermatozoa cryopreserved at –196 degrees C.  Reproduction, 122(3):463-467.

Okuyama M, Isogai S, Saga M, Hamada H. and Ogawa S. 1990. In vitro fertilization and artificial insemination by cryopreserved spermatozoa in the mouse. J Fertil Implant, 7:116-119.

Parrington J, Swann K, Schevchenko VI, essay AK, and Lai FA. 1996.  Calcium oscillation in mammalian eggs triggered by a soluble sperm protein.  Nature, 379:364-368.

Perreault SD, Barbee RR. and Slott V.  1988.  Importance of glutathione in the acquisition and maintenance of sperm nuclear decondensing ability in maturing hamster oocytes. Dev Biol., 125:181-186.

Tada N, Sato M, Yamanoi J, Mizorogi T, Kasai K. and Ogawa S. 1990. Cryopreservation of mouse spermatozoa in the presence of raffinose and glycerol. J Reprod Fertil., 89:511-516.

Toyoda Y. and Chang MC. 1974. Fertilization of rat eggs in vitro by epididymal spermatozoa and the development of eggs following transfer. J Reprod Fertil  36:9-22.

Uehara T. and Yanagimachi R. 1976.  Microsurgical injection of spermatozoa into hamster eggs with subsequent transformation of sperm nuclei into male pronuclei. Biol Reprod., 15:467-470.

Wakayama T, Whittingham DG. and Yanagimachi R.  1998. Production of normal offspring from mouse oocytes injected with spermatozoa cryopreserved with or without cryoprotection. J Reprod Fertil., 112:11-17.

Wildt DE, Monfort SL, Donoghue AM, Johnson LA. and Howard J. 1992. Embryogenesis in conservation biology or how to make an endangered species embryo. Theriogenology, 37:161-184.

Yanagida K, Yanagimachi R, Perreault SD and Kleinfeld RG.  1991.  Thermostability of sperm nuclei assessed by microinjection into hamster oocytes.  Biol Reprod., 44:440-447.

INTRACYTOPLASMIC SPERM INJECTION (ICSI) SEBAGAI

February 3, 2010

INTRACYTOPLASMIC SPERM INJECTION (ICSI) SEBAGAI TEKNIK REPRODUKSI BANTUAN UNGGULAN

TAKDIR SAILI1*, SYAHRUDDIN SAID2, MOHAMAD AGUS SETIADI3,  SRIHADI AGUNGPRIYONO4, MOZES R.TOELIHERE3, ARIEF BOEDIONO4

Program Studi Produksi Ternak, Fak.Pertanian, Universitas Haluoleo, Kendari 932321 

Pusat Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi-LIPI, Jalan Raya Bogor Km.46 Cibinong 169112 

Departemen Klinik, Reproduksi dan Patologi FKH-IPB. Kampus Darmaga, Bogor 166803 

Departemen Anatomi, Fisiologi dan Farmakologi FKH-IPB. Kampus Darmaga, Bogor 166803

ABSTRAK

Beberapa teknik fertilisasi mikro telah diterapkan untuk mengatasi masalah infertilitas pria, namun hanya intracytoplasmic sperm injection (ICSI) yang mampu meningkatkan secara nyata keberhasilan fertilisasi, implantasi dan kelahiran. Pada perkembangannya teknik ICSI juga telah diterapkan pada beberapa jenis hewan sebagai suatu model untuk mempelajari kemampuan fertilisasi berbagai jenis spermatozoa yang secara alami atau melalui fertilisasi in vitro tidak bisa membuahi sel telur. Walaupun keberhasilan teknik ICSI telah dapat mengatasi masalah infertilitas pada pria, teknik ICSI masih mempunyai potensi negatif yang mungkin muncul pada anak hasil ICSI. Namun demikian, hal ini perlu penelitian lebih lanjut untuk membuktikannya.

Kata kunci : ICSI, infertilitas, fertilisasi in vitro

ABSTRACT

Since the application of intracytoplasmic sperm injection (ICSI) for overcoming male infertility problem, no other microfertilization techniques have been success to increase fertilization, implantation and birth rates. So far, ICSI has been applied in many species of animal as a model of study on fertilizing capacity of spermatozoa which can not fertilize the oocyte either naturally or by in vitro fertilization. Although the ICSI has been success to eliminate male infertility problems, it still has potential disadvantages which can occur in ICSI-produced babies. However, these potential disadvantages should be proven scientifically in the future.

Key words: ICSI, infertility, in vitro fertilization

Sejak keberhasilan teknik In Vitro Fertilization (IVF) sebagai salah satu teknik reproduksi bantuan pada manusia yang dilaporkan oleh Steptoe dan Edwards (1978), teknik ini telah memicu perkembangan teknik lain yang mendukung keberhasilan fertilisasi, seperti teknik induksi ovulasi, pengambilan sel telur, kultur oosit dan embrio, kriopreservasi embrio dan transfer embrio (TE).  Demikian pula dengan teknik fertilisasi itu sendiri telah berkembang ke arah fertilisasi mikro yang ditujukan untuk mengatasi masalah gangguan reproduksi pada pasangan suami istri.

Kemajuan yang dicapai oleh teknik IVF dan TE telah banyak mengatasi persoalan infertilitas pada pria dan penyumbatan saluran tuba pada wanita dalam upaya memperoleh kehamilan dan kelahiran anak (Edwards et al. 1980), namun beberapa kasus yang berhubungan dengan kegagalan fertilisasi belum dapat tertangani dengan baik. Oleh karena itu beberapa teknik fertilisasi mikro telah dikembangkan untuk mengatasi persoalan ini, antara lain Zona Thinning (ZT), Zona Drilling (ZD), Partial Zona Dissection (PZD), Sub Zonal Insemination (SUZI) dan Intracytoplasmic Sperm Injection (ICSI). Di antara teknik tersebut hanya ICSI yang berkembang baik dan menghasilkan perubahan yang nyata terhadap keberhasilan fertilisasi secara mikro (Palermo et al. 1992). Suatu hal yang menarik adalah teknik ini awalnya dikembangkan hanya untuk membuktikan bahwa peristiwa dekondensasi spermatozoa dan pembentukan pronukleus jantan tidak terjadi sebelum spermatozoa masuk ke dalam sel telur (Hiramoto, 1966).

Dewasa ini, teknik ICSI telah banyak diaplikasikan pada manusia dengan berbagai capaian keberhasilan yang menggembirakan. Sumber spermatozoa yang digunakan dalam teknik ICSI sangat beragam bahkan spermatozoa yang immotilpun  dapat digunakan untuk menghasilkan kehamilan (Okada et al., 1999). Hal ini merupakan kelebihan yang dimiliki oleh teknik ICSI dibanding teknik fertilisasi bantuan yang lain.

Walaupun teknik ICSI dianggap sederhana, tetapi dalam aplikasinya melibatkan berbagai macam persoalan termasuk masalah peralatan dan kemampuan teknik operator yang pada gilirannya akan mempengaruhi tingkat keberhasilan ICSI. Teknik ICSI merupakan teknik manipulasi pembuahan secara in vitro yang menyalahi aturan pembuahan alami sehingga potensi hambatan fertilisasi yang dibawa oleh spermatozoa sangat besar. Hal ini disebabkan oleh hilangnya kesempatan bagi spematozoa untuk melangsungkan proses pendewasaan secara alamiah seperti kapasitasi dan reaksi akrosom. Namun demikian, dalam perkembangannya kedua peristiwa tersebut telah dapat dilakukan secara in vitro sehingga spermatozoa yang diinjeksikan mampu melangsungkan proses fertilisasi.

Makalah ini akan memberikan beberapa informasi mengenai ICSI yang meliputi sejarah perkembangan manipulasi mikro dan pemanfaatan teknik ICSI khususnya pada manusia.

Sejarah Mikro Injeksi

Pada awal abad ke-20 para peneliti telah mengembangkan beberapa teknik manipulasi mikro yang secara langsung diterapkan pada sel hidup. Kite pada tahun 1911, telah berhasil memisahkan pronukleuas yang baru terbentuk pada zigot menggunakan jarum mikro (Chambers, 1940). Selanjutnya Kite berpikir tentang apa yang akan terjadi jika spermatozoon diinjeksikan secara langsung ke dalam sel telur (Lillie, 1914). Pemikiran tersebut kemudian diwujudkan dengan menginjeksikan  dua sampai dua belas spermatozoa starfish ke sebuah sel telur ikan yang sama, namun tak satupun sel telur terbuahi.

Beberapa alat yang menunjang kerja manipulasi mikro telah berhasil dibuat antara lain joy stick oleh Emmerson pada tahun 1928 yang dapat mengatur secara langsung pergerakan alat manipulasi mikro sesuai keinginan operator (El Badry, 1963). Alat ini selanjutnya dikembangkan oleh de Fonbrune pada tahun 1928 menggunakan prinsip hidrolik. Selain  itu de  Fonbrune (1934) juga menciptakan alat microforge yang masih tetap dipergunakan oleh banyak peneliti hingga sekarang dan memperkenalkan teknik membuat alat-alat mikro. Teknik manipulasi mikro telah berkembang secara bertahap lebih dari satu abad dan sudah mencapai tingkat keberhasilan hingga para peneliti telah mampu memotong sebuah kromosom tunggal.

            ICSI sebagai suatu teknik yang memungkinkan seseorang untuk memasukkan spermatozoon ke dalam sel telur untuk tujuan fertilisasi dengan bantuan alat mikromanipulator telah mampu meningkatkan angka fertilisasi spermatozoa yang berasal dari pria infertil. Kelebihan utama teknik ini adalah dapat menggunakan spermatozoa tanpa mempertimbangkan motilitasnya yang merupakan syarat mutlak pada IVF (Okada et al., 1999; Kuramoto et al., 1997). Beberapa jenis hewan telah lahir dari hasil ICSI yang menggunakan spermatozoa immotil (Yanagimachi, 2001). Satu hal yang perlu dicatat bahwa ICSI dalam aplikasinya telah berkembang dengan berbagai teknik yang berbeda untuk menghasilkan pembuahan normal.

Penelitian-penelitian selanjutnya selain melaporkan keberhasilan ICSI dalam mendukung pembentukan pronukleus dan perkembangan embrio hingga tahap blastosis, juga melaporkan keberhasilan ICSI pada hewan dalam menghasilkan anak. Beberapa kelahiran anak hewan hasil ICSI telah dilaporkan pada kelinci (Hosoi et al., 1988 dan Iritani, 1989), mencit (Kimura and Yanagimachi, 1995), kucing (Pope et al., 1998), kuda (Cochran et al.,1998), domba (Gomez et al., 1998), sapi (Hamano et al., 1999), kera (Hewitson et al., 1999), babi (Martin, 2000) dan tikus (Said et al., 2003). Penerapan ICSI secara langsung pada manusia dilakukan pertama kali oleh Lanzendorf et al.(1988), namun hasilnya hanya mencapai pembentukan pronukleus jantan dan betina. Keberhasilan monumental penerapan teknik ICSI pada manusia diawali oleh Palermo et al. (1992) dimana embrio hasil ICSI telah mampu berkembang setelah transfer hingga tahap kehamilan.

Penerapan Teknik ICSI pada Manusia

            Palermo et al. (1992) memberikan komentar bahwa setelah belasan tahun mengerjakan IVF dan gamet pada manusia, tidak ada teknik yang lebih memuaskannya selain dari ICSI. Teknik tersebut dengan nyata mampu memecahkan persoalan dalam membantu pembuahan, khususnya yang berhubungan dengan masalah ketidaksuburan pada pria.

            Berdasarkan penelitian Patrizio dan Broomfield (1999) didapatkan sekitar 30-40% kasus ketidaksuburan pada pasangan suami istri disebabkan oleh ketidaksuburan pada pria. Selanjutnya dijelaskan bahwa secara umum ketidaksuburan pria dapat disebabkan karena kelainan pada spermatozoa seperti azoospermia (gagalnya proses spermatogenesis yang menyebabkan tidak adanya spermatozoa dalam semen), oligozoospermia (subnormal konsentrasi spermatozoa yang diejakulasikan), asthenozoospermia (hilangnya atau terjadi penurunan motilitas spermatozoa), teratozoospermia (suatu kondisi dimana terdapat spermatozoa dengan bentuk tidak normal dalam semen) atau karena kombinasi diantaranya..

            Cohen et al. (1994) mengemukakan bahwa pasangan yang gagal memperoleh pembuahan setelah IVF, maka peluang terjadinya pembuahan jika IVF dilakukan untuk kedua kalinya kurang dari 25%. Pada penelitian yang lain, Palermo et al. (1993) melaporkan tingkat kehamilan yang tinggi (40%) ketika melakukan ICSI pada 38 pasangan yang telah gagal total dengan IVF. Hasil ini memperlihatkan bahwa ICSI mampu menolong pasien yang telah gagal dengan IVF.

            Melalui ICSI, pembuahan lebih efisien dan tepat karena hanya memerlukan satu spermatozoa untuk membuahi sel telur. Bahkan ICSI pada beberapa jenis hewan seperti mencit tidak mempertimbangkan motilitas dan viabilitas spermatozoa (Wakayama and Yanagimachi, 1998). Oleh karena itu, Silber et al. (1994) mengemukakan bahwa selama dimungkinkan untuk mengambil spermatozoa dari epididimis atau testis dengan pembedahan mikro, maka ICSI menjadi teknik pilihan yang tepat untuk menangani kasus azoospermia.  Selanjutnya dikatakan bahwa dengan kombinasi teknik Microsurgical epididymal sperm aspiration (MESA) dan ICSI dapat diperoleh pembuahan dan kehamilan yang tinggi. Akan tetapi teknik ini penanganannya memakan waktu cukup lama dan juga memerlukan kemampuan khusus, membutuhkan anestesi total, dan dari beberapa kasus menimbulkan trauma setelah operasi. Karena alasan inilah Craft et al. (1995) memperkenalkan cara lain yaitu teknik percutaneous epididymal sperm aspiration (PESA). PESA adalah teknik pengambilan spermatozoa epididimis dengan cara memasukkan jarum berukuran sangat kecil langsung ke kepala epididimis. Dibandingkan dengan MESA, teknik ini sangat sederhana dan dapat dikerjakan dengan anestesi lokal dan waktu yang digunakan relatif singkat (sekitar 10-20 menit).

Pelaksanaan ICSI

Pasien ICSI umumnya adalah pasangan suami isteri yang telah diperiksa kondisi reproduksinya dan dipastikan bahwa suami tidak dapat menghasilkan spermatozoa yang memenuhi syarat untuk melakukan fertilisasi baik secara alami maupun melalui fertilisasi in vitro. Untuk mendapatkan jumlah sel telur yang memenuhi syarat kualitas dan kuantitas untuk tujuan ICSI maka istri diberi perlakuan induksi hormon. Mansour et al. (1994) mengemukakan bahwa pengambilan sel telur paling baik dilakukan 36 jam setelah injeksi hormon human chorionic gonadotrophin (hCG). Hal ini dimaksudkan agar sel telur yang diambil sudah cukup matang sehingga siap dibuahi oleh spermatozoa. Sebelum ICSI dilakukan kumulus sel telur dibebaskan dengan menginkubasi sel telur beberapa saat di dalam medium penyangga HEPES yang mengandung 80mIU/ml hyaluronidase. Sel telur selanjutnya dipindahkan ke medium kultur dan diinkubasi sambil menunggu saat manipulasi. Hanya sel telur yang mempunyai polar bodi pertama (PB-I) yang dipilih untuk ICSI. Selanjutnya dilakukan seleksi terhadap spermatozoa yang akan digunakan melalui berbagai macam metode seleksi, seperti swim up atau side migration (Bourne et al., 1995).

Selain melakukan seleksi spermatozoa sebelum penerapan ICSI juga dilakukan immobilisasi atau menghentikan pergerakan spermatozoa. Hal ini dilakukan agar mudah memasukkan atau mengambil spermatozoa ke dalam pipet injeksi dan spermatozoa yang telah terambil tidak melakukan pergerakan lebih lanjut dalam pipet injeksi. Selain itu imobilisasi juga dapat mendukung terjadinya proses dekondensasi spermatozoa (Boediono, 2001). Mengimmobilisasi spermatozoa umumnya dilakukan dengan menekan ekor spermatozoa sampai ke dasar petri (Dozortzev et al., 1995) atau dengan memisahkan kepala dan ekor dengan cara sonikasi (Kuretake et al., 1996). Selanjutnya, ICSI dilakukan dengan cara memasukkan satu spermatozoa ke dalam sel telur secara mekanik dengan menggunakan alat mikromanipulator di bawah mikroskop inverted.

            Salah satu masalah serius pada injeksi spermatozoa khususnya pada manusia adalah menyeleksi spermatozoa normal untuk manipulasi. Van Steirteghem et al. (1993) telah mengidentifikasi spermatozoa hidup dalam semen dengan menyeleksi spermatozoa menggunakan metode percoll density dan menambahkan 2-deoxyadenosin (2DA) dan pentoxyfylline untuk merangsang motilitas spermatozoa. Lebih lanjut dikatakan bahwa  kemungkinan 2DA bersifat toksik terhadap embrio yang dapat mengakibatkan penahanan pada pembelahan dan perkembangan embrio selanjutnya. Akan tetapi, Nagy et al. (1995) mengemukakan bahwa peningkatan jumlah spermatozoa yang abnormal dalam semen bukan merupakan faktor kritis yang menurunkan tingkat fertilisasi setelah ICSI. Selain itu, Saili dan Said (2005) melaporkan bahwa spermatozoa yang nyata telah matipun karena perlakuan pembekuan tanpa krioprotektan dan perlakuan pemisahan kepala spermatozoa dengan ekor masih mampu mendukung pembentukan pronukleus jantan dan betina setelah diinjeksikan ke dalam sel telur tikus. Hal ini merupakan bukti tambahan bahwa untuk tujuan fertilisasi melalui teknik ICSI, spermatozoa yang digunakan tidak perlu motil dan utuh.

Resiko Penggunaan Teknik ICSI

            Pada kenyataannya ICSI melibatkan suatu mekanisme interaksi spermatozoa dan sel telur yang sangat berbeda dengan pembuahan secara alami. Memasukkan spermatozoa langsung ke dalam sel telur, bukan hanya fungsi sel kumulus dan zona pellusida yang terabaikan tetapi juga oolemma, dimana secara alami merupakan komponen yang berperan sebagai penyeleksi dan pendewasa spermatozoa sebelum sel telur dan spermatozoa bersatu. Kenyataan inilah yang memungkinkan ICSI memiliki potensi resiko yang tidak kecil dan menjadi topik perdebatan serius hingga saat ini. Beberapa hal penting yang menjadi perdebatan adalah: pertama, karena spermatozoa dimasukkan langsung ke dalam sel telur tanpa melalui proses seleksi secara alami, maka besar kemungkinan spermatozoa yang dimasukkan adalah spermatozoa rusak atau spermatozoa yang abnormal (Mansour, 1998). Cummins dan Jequier (1994) telah memperingatkan bahwa terdapat kerusakan genetik yang tidak jelas pada beberapa kasus faktor ketidaksuburan pria dan konsekuensi resiko penggunaan teknik mikro untuk membantu pembuahan; kedua, terdapat kemungkinan memasukkan material asing yang tidak diketahui ke dalam sitoplasma selama injeksi, misalnya polyvinyl pyrolidone (PVP), minyak, kontaminasi percoll dan lain-lain. Resiko yang lebih parah lagi bahwa kepala spermatozoa mampu mengikat DNA asing (Maione et al., 1998). Pengikatan ini semakin besar peluangnya karena spermatozoa sebelum diinjeksi ke dalam sel telur diimobilisasi terlebih dahulu yang mengakibatkan rusaknya membran plasma spermatozoa, dimana diketahui bahwa pada daerah tersebut terdapat faktor penghambat interaksi antara DNA asing dengan spermatozoa; ketiga, adanya kemungkinan rusaknya meiotic spindle pada sel telur pada saat injeksi; keempat, terjadinya luka pada spermatozoa akibat immobilisasi sebelum injeksi merupakan salah satu faktor rusaknya DNA spermatozoa. Hal ini terjadi karena terdapat perbedaan lingkungan di dalam spermatozoa yang mengandung Na+ rendah dan K+ tinggi sedangkan lingkungan di luar sel saat manipulasi mengandung Na+ tinggi dan K+ yang rendah. Perbedaan inilah menurut Martin et al. (1988) dan Rybouchkin et al. (1996) akan mengakibatkan kerusakan kromosom. Namun demikian, semua potensi negatif yang mungkin muncul sebagai keterbatasan teknik ICSI masih membutuhkan penelitian lebih lanjut untuk membuktikannya. Beberapa peneliti melaporkan bahwa kejadian congenital malformation pada bayi yang lahir melalui ICSI berkisar 2.3-2.6% (Coulam et al., 1996; Palermo et al., 1996; Bonduelle et al., 1997; Bourne et al., 1997; Wisanto et al., 1997), sedangkan yang lahir melalui IVF dan lahir melalui perkawinan secara alami rata-rata 2.2% (Tarlatzis, 1997).

            Sejauh ini, teknik ICSI baik menggunakan spermatozoa ejakulat, spermatozoa epididimis atau testis telah mampu memberikan tingkat pembuahan dan keberhasilan kelahiran. Kelainan infertilitas pada pria seperti azoospermia atau infertil secara immunologi, maupun infertil yang tidak bisa dijelaskan yang sebelumnya gagal dengan teknik IVF konvensional, dengan teknik ICSI mampu memberikan hasil fertilitas yang memuaskan.

Daftar Pustaka

Boediono, A., 2001.  Sperm immobilization prior to intracytoplasmic sperm injection (ICSI) and oocyte activation improve early development of microfertilized goat oocytes.  Reprotech. 1:29-34.

Bonduelle, M., Wilkens, A., Buysee, A., van Assche, E., Wisanto, A., Devroey, P., van Steirteghem, A.C., and Liebaers, I., 1997.  Prospective follow-up studi of 877 children born after intracytoplasmic sperm injection (ICSI) with ejaculated, epididymal and testicular spermatozoa and after replacement of cryopreserved embryos obtained after ICSI. Hum.Reprod. (Suppl.4) 11:131-155.

Bourne, H., Stern, K., Clarke, G., Pertile, M., Speirs, A., and Baker, H.W., 1997.  Delivery of normal twins following the intracytoplasmic injection  of spermatozoa with 47, XXY Klinfelter’s syndrome.  Hum.Reprod. 12:2447-2450.

Bourne, H., Riching, N., Liu, D.Y., Clarke, G.N., Harari, O., and Baker, H.W.G.,  1995.   Sperm preparation for intracytoplasmic sperm injection: methods and relationship to fertilization results. Reprod.Fertil.Dev. 7:177-183.

Chambers, R., 1940.  The micromanipulation of living cells.  The Cells and Protoplasm. Am. Assoc.Adv. Sci. 40:20-30.

Cochran, R., Meintjes, M., Roggio, B., and Hylan, D.,  1998.  Live foals produced from sperm injected oocytes derived from pregnant mares.  J.Equine.Vet. Sci. 18:736-740.

Cohen, J., Aikani, M., Munne, S., and Palermo, G.D., 1994. Micromanipulation in clinical management of fertility disorders. Reprod.Endoc. 12:151-168.

Coulam, C.B., Opashl, M.S., Sherins, R.J., Thorsell, L.P., Dorfmann, A., Krysa, L., Fugger, E., and Schulman, J.D., 1996.  Comparisons of pregnancy loos patterns after intracytoplasmic sperm injection and other assisted reproductive technologies. Fertil.Steril. 65:1157-1162

Craft, I., Tsirigotis, M., Bennet, V., Taranissi, M., Khalifa, Y., Hogewind, G., and Nicholson, N.,  1995. Percutaneous epididymal sperm aspiration and intracytoplasmic sperm injection in the management of infertility due to obstructive azoospermia. Fertil.Steril.  63:1038-1042.

Cummins, J.M.,  and Jequier, A.M., 1994. Treating male infertility needs more clinical andrology, not less. Hum.Reprod.  9:1214-1219.

De Fonbrune P., 1934.  Demonstration d’un micromanipulator pneumatique et d’un apparal pour la fabrication des microinstrument. Ann.Physiol.Physiochem. 10:4.

Dozortzev, D., Rybouchkin, A., Sutter, P., Qian, C., and Dhont, M., 1995. Human oocyte activation following intracytoplasmic sperm injection: the role of the sperm cell. Hum. Reprod.  10:403-407.

Edwards, RG., Steptoe, P.C., and Purdy J.M., 1980.  Establishing full-term human pregnancies using cleaving embryos grown in vitro. Br.J.Obstet.Gynaecol.  87:737-756.

El Badry H. 1963.  Micromanipulators and Micromanipulation.  Academic Press, New York.

Gomez, M.C., Catt, J.W., Evans, G., and Maxwell, W.M.C.,  1998.  Cleavage, development and competence of sheep embryos fertilized by intracytoplasmic sperm injection and in vitro fertilization. Theriogenology.  49:1143-1154.

Hamano, K., Li, X., Qian, X.Q., Funauchi, F., Furudate, M., and Minato, Y., 1999.  Gender preselection in cattle with intracytoplasmically injected, flow cytometrically sorted sperm heads. Biol. Reprod.  60:1194-1197.

Hewitson, L.C., Dominiko, T., Takahashi, D., Martinovich, C.,  Ramalho-Santos, J., Sutovsky, P., Fanton, J., Jacob, D., Monteith, D., Neuringer, M., Battaglia, D., Simerly, C., and Schatten, G., 1999.  Unique checkpoints during the first cycle of fertilization after intracytoplasmic sperm injection in rhesus monkey. Nat.Med.  5:431-433.

Hiramoto, Y., 1966.  Microinjection of the live spermatozoa into see urchin eggs. Exp.Cell.Res.  27:416-426.

Hosoi, Y., Miyake, M., Utsumi, K., and Iritani, A.,  1988.  Development of rabbit oocytes after microinjection of spermatozoa.  In: Proceedings of the 11th International Congress on Animal Reproduction and Artificial Insemination. Abst.Pp.331.

Iritani, A., 1989. Micromanipulation of oocyets and embryos. In: Proceedings of 13rd World Congress on Fertility and Sterility, Marrakech, Morocco, Oct.1-5, 1989.  Parthenon Publishing, Karnforth, UK. 

Kimura, Y., and Yanagimachi, R.,  1995. Intracytoplasmic sperm injection in the mouse. Biol. Reprod.  52:709-720. 

Kuramoto, T., Boediono, A., Sugioka, M., Umebayashi, T., Fukuda, K., Motoishi, M., and Komatsu, K., 1997. Pregnancies from obstructive azoospermia patients after intracytoplasmic sperm injection (ICSI) with testicular spermatozoa. In: Proceedings of 10th World Congress on In Vitro Fertilization and Assisted Reproduction, Vancouver Canada 24-28 May 1997. Pp.523-525.

Kuretake, S., Kimura, Y., Hoshi, K., and Yanagimachi, R., 1996. Fertilization and development of mouse oocytes injected with isolated sperm heads. Biol.Reprod.  55:789-795.

Lanzendorf, S.E., Maloney, M.K., Veeck, L.L., Slusser, J., Hodgen, G.D., and Rosenwaks, Z.,  1988.  A preclinical evaluation of pronuclear formation by microinjection of human spermatozoa into human oocytes. Fertil.Steril. 49:835-842.

Lillie, F.R., 1914.  Studies of fertilization. IV. The mechanism of fertilization in Arbacia.   J.Exp.Zool.  16:523-590.

Maione, B., Lavitrano, M., Spadafora, C., and Kiessling, A.A., 1998. Sperm-mediated gene transfer in mice. Mol.Reprod.Dev.  50:406-409.

Mansour, R.,  1998.  Intracytoplasmic sperm injection: a state of the art technique. Hum.Reprod. 4:43-56.

Mansour, R., Aboulghar, M.A., and Serour, G.I., 1994. Study of the optimum time for human chorionic gonadotropin-ovum pick-up interval in in vitro fertilization. J.Ass.Reprod.Gen.  11:428-481.

Martin, M.J.,  2000.  Development of in vivo matured porcine oocytes following intracytoplasmic sperm injection.  Biol.Reprod.  63:109-112.

Martin, R.H., Ko, E., and Rademaker, A., 1988. Human sperm chromosome complements after microinjection of hamster eggs. J.Reprod.Fertil.  84:179-186.

Nagy, Z.P., Liu, J., Joris, H., Verheyen, G., Tournaye, H., Camus, M., Derde, M.C., Devroey,P., and van Steirteghem, A.C., 1995. The result of intracytoplasmic sperm injection is not related to any of the three basic sperm parameters. Hum.Reprod.  10:1123-1129.

Okada, H., Fujioka, H., Tatsumi, N., and Fujisawa, M.,   1999.  Assisted reproduction for infertile patients with immotile spermatozoa associated with autosomal dominant polysystic kidney disease.  Hum.Reprod. 14:110-113.

Palermo, G.D., Cohen, J., and Rosenwaks, Z., 1996. Intracytoplasmic sperm injection: a powerful tool to overcome fertilization failure. Fertil.Steril. 65:889-908.

Palermo, G.D., Joris, H., Derde, M.P., Camus, M., Devroey, P., and van Steirteghem, A.C., 1993. Sperm characteristics and outcome of human assisted fertilization by subzonal insemination and intracytoplasmic sperm injection. Fertil.Steril. 59:826-835.

Palermo, G.D., Joris, H., Devroey, P., and van Steirteghem, A.C., 1992. Pregnancies after intracytoplasmic injection of single spermatozoon into an oocyte. Lancet.  340:17-18.

Patrizio, P., and Broomfield, D., 1999. The genetic basis of male infertility. In: Male fertility and infertility. Glover, T.D., and Barratt, C.L.R., (eds). Cambridge University Press, UK. Pp:162-179

Pope, C.E., Johnson , C.A., McRae, M.A., Keller, G.L., and Dresser, B.L., 1998. Development of embryos produced by intracytoplasmic sperm injection of domestic cat oocytes. Anim.Reprod.Sci. 53:221-236. 

Rybouchkin, A.V., de Sutter, P., and Dhont, M., 1996. Unprotected freezing of human spermatozoa axerts a detrimental effect on their oocyte activating capacity and chromosome integrity. Zygote.  4:263-268.

Said, S., Saili, T., dan Tappa, B.,  2003. Pengaktifan dan pembuahan sel telur tikus setelah disuntik dengan kepala spermatozoa. Hayati.  10:96-99.

Saili, T., and Said, S., 2005. The ability of rat cauda epididymal spermatozoa cryopreserved in liquid nitrogen without cryoprotectants to induce pronuclear formation. J.Vet (Submitted).

Silber, S.J., Nagy, Z.P., and Liu, J., 1994. Conventional in vitro fertilization versus intracytoplasmic sperm injection for patients requiring microsurgical sperm aspiration. Hum.Reprod.  9:1705-1709.

Steptoe, P.C., and Edwards, R.G.,  1978.  Birth after the re-implantation of a human embryo. Lancet. ii:366.

Tarlatzis, B., 1997. Sons of manipulated oocytes. Congress on Human Oocytes: From Physiology to IVF, Bologna, Italy. Abstr.Pp.50.

Van Steirteghem, A.C., Nagy, Z.P., Joris, H., Liu, J., Staessen, C., Smitz, J., Wisanto, A., and Devroey, P., 1993. High fertilization and implantation rates after intracytoplasmic sperm injection. Hum.Reprod.  8:1061-1066.

Wakayama, T., and Yanagimachi, R., 1998.  Development of normal mice from oocytes injected with freeze-dried spermatozoa. Nat.Biotech. 16:639-641.

Wisanto, A., Bonduelle, M., Camus, M.,  Tournaye, H., Magnus, M., Liebaers, I., van Steirteghem, A.C., Devroey, P., 1997.  Obstetric outcome of 904 pregnancy after intracytoplasmic sperm injection. Hum.Reprod. (Suppl.4) 11:121-129.

Yanagimachi, R., 2001.  Gamete manipulation for development: new methods for conception.  Reprod. Fertil. Dev. 13:3-14.


* Penulis untuk korespondensi : Telp.0251-421-823. HP: 0815-952-0103. E-mail :takdir69@yahoo.com

ANALISIS MOLEKULER TINGKAT KEKERABATAN

February 3, 2010

ANALISIS MOLEKULER TINGKAT KEKERABATAN BABI HUTAN DAN BABI RUSA

Takdir Saili1, E.T. Margawati2 dan Muladno3

1Program Studi Produksi Ternak, Faperta-Unhalu, Kendari

2Pusat Penelitian Bioteknologi-LIPI, Cibinong

3Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor

 

MOLECULAR-BASED ANALYSIS OF KINSHIP BETWEEN BABIRUSA AND PIGS

 ABSTRACT

 Babirusa is generally grouped with pigs, although they differ from their more familiar relatives in several important ways such as performance, eating behavior and litter size. To determine whether or not Babirusa is genetically similar to pigs, the blood DNA analysis of Babirusa has been conducted to analyze the similarity of their DNA profile.  The Pre-1 (specific for pigs) and D-Loop (specific for deer) were used as a primer of DNA sample amplification using PCR machine. Subsequently, the amplified DNA was run in gel electrophoresis. The results showed that DNA sample was amplified successfully with Pre-1 primer but not D-Loop. It indicated that DNA sample had a number of DNA sequences that complemented with Pre-1 primer. Based on the results, it was concluded that Babirusa is genetically same as pigs. 

Key words : Babirusa, Pre-1, D-Loop, PCR and Electrophoresis

PENDAHULUAN

Latar Belakang

Walaupun babirusa dikelompokkan ke dalam jenis babi, tetapi ada beberapa perbedaan penting dibanding kebanyakan babi. Perbedaan tersebut antara lain adalah cara mencari makan (babirusa tidak suka menggali tanah untuk memakan umbi-umbian, mereka lebih menyukai buah-buahan yang jatuh untuk dikonsumsi) dan jumlah anak (anak babirusa lebih sedikit, umumnya hanya dua ekor dibanding babi pada umunya). Babirusa mempunyai badan lebih besar, berkulit tebal dan berbulu kasar serta jarang dan warna kulit hitam kecoklatan dibanding babi hutan biasa. Selain itu, ciri utama babirusa adalah adanya sepasang taring panjang yang mencuat ke luar (Anonimous, 2002).

Untuk dapat memastikan apakah ada hubungan kekerabatan antara babirusa dan babi hutan biasa atau babi yang sudah didomestikasi, maka dibutuhkan serangkaian analisis secara molekuler untuk menghilangkan keraguan bagi semua pihak dalam menyatakan status babirusa, seperti umumnya kontroversi yang muncul di kalangan masyarakat umum.

Analisis molekuler yang dimaksud adalah menentukan kualitas dan kuantitas molekul DNA pada sampel darah babirusa kemudian dipasangkan dengan  primer yang berasal dari lokus tertentu pada kromosom babi.  Kegiatan ini melibatkan serangkaian kerja yang diawali dengan isolasi, ekstraksi, purifikasi dan analisa DNA.

Pada dasarnya isolasi dan ekstraksi DNA adalah serangkaian proses untuk memisahkan DNA dari komponen sel lainnya.  Proses tersebut meliputi tiga tahapan, yaitu: penghancuran sel, penghilangan protein dan RNA serta pemurnian DNA. Secara kimiawi penghancuran sel dilakukan dengan memanfaatkan senyawa kimia seperti lisozim, EDTA (etilendiamin tetraasetat), dan SDS (sodium dodesil sulfat). EDTA berfungsi sebagai perusak sel dengan cara mengikat ion magnesium yang mempertahankan integritas sel. Sedangkan SDS berfungsi untuk merusak membran sel. Kotoran yang ditimbulkan akibat pengrusakan sel dibersihkan dengan cara sentrifugasi, sehingga yang tertinggal hanya nukleotida (DNA dan RNA). Untuk menghilangkan protein dari larutan digunakan fenol (mengikat protein dan sebagian kecil RNA) dan kloroform (membersihkan protein dan polisakarida dari larutan). Protein juga dapat dihilangkan dengan bantuan enzim proteinase, sedangkan RNA yang tertinggal dapat dibersihkan dengan bantuan enzim RNase hingga tinggal DNA yang terdapat di dalam larutan.  Selanjutnya DNA dicampur dengan etanol dan NaCl yang berfungsi untuk memekatkan dan memisahkan DNA dari larutan dan mengendapkannya.  Endapan DNA yang tampak seperti tepung berwarna putih tersebut selanjutnya dimurnikan lagi sebelum kemudian dilarutkan dengan penambahan air atau larutan TE (Tris-EDTA). DNA yang diperoleh ini kemudian digunakan untuk berbagai analisis molekuler (Muladno, 2002).

Untuk mengetahui apakah pada sample DNA yang kita gunakan mengandung potongan sekuens DNA yang berkomplemen dengan primer yang kita gunakan, maka harus dilakukan proses pemasangan (hybridisasi) antara primer yang telah diketahui sekuens DNA-nya dengan DNA pada sample. Oleh karena sekuens DNA yang akan dipasangkan  tergolong pendek, maka sekuens tersebut terlebih dahulu dilipatgandakan jumlahnya (Wolfe, 1993). Proses ini dapat dilakukan dengan bantuan mesin polymerase chain reaction (PCR). Mesin ini bekerja atas jasa baik enzim polimerase yang dapat mensintesis komplemen DNA asal (DNA template) dalam suatu campuran yang mengandung 4 jenis basa DNA dan 2 fragment DNA yang mengapit sekuens DNA target. Ada beberapa tahap kerja mesin ini, yaitu tahap pemanasan yang menyebabkan DNA akan membelah menjadi untai tunggal; tahap pendinginan yang akan memberi kesempatan kepada primer untuk menemukan dan berpasangan dengan komplemennya pada sekuens DNA target dan tahap pelipatgandaan jumlah DNA dengan bantuan enzim polimerase. Tahap-tahap ini akan berulang dalam beberapa puluh siklus. DNA yang dihasilkan pada satu siklus akan menjadi DNA template pada siklus berikutnya sehingga jumlah DNA pada setiap siklus akan bertambah secara eksponensial.

Tujuan Penelitian

Penelitian ini bertujuan untuk menganalisis kandungan DNA pada sample darah babirusa baik secara kualitatif maupun kuantitatif serta untuk mengetahui apakah pada sample DNA tersebut mengandung sekuens DNA yang berkomplemen dengan primer yang digunakan (Pre-1, spesifik babi dan D-Loop, spesifik rusa). Hasil pengamatan ini selanjutnya akan menjadi salah satu bahan informasi dalam upaya mengetahui sejauh mana kekerabatan babirusa dan babi pada umumnya berdasarkan analisis DNA.

BAHAN DAN METODE

Bahan dan Peralatan

Hewan Percobaan. Hewan percobaan yang digunakan adalah 24 ekor babi rusa.

Bahan‑bahan. Bahan yang digunakan adalah bahan untuk pengambilan sampel darah, ekstraksi DNA(Lysis buffer: 0.32 M sukrosa, 1% v/v Triton X‑100, 5 mM MgC12, 10 mM Tris Cl, pH = 7.4; Rinse buffer: 75 mM NaCl, 50 mM EDTA, pH 8.0; Digestion buffer: 200 mM NaCl, 50 mM Tris‑Cl, 1‑mM EDTA, pH = 8.0, 1% (w/v) SDS, 0.5 mg/ml Proteinase K, 0.1mg/ml RNase; Solution E : TE pH = 7.5, 0.02 mg/ml RNase), amplifikasi DNA melalui PCR (sample DNA sebagai cetakan, Taq polymerase, primer, dNTPs, buffer), dan elektroforesis (agarose 1%, 2%, 1 x TAE, Ethidium Bromida, loading dye, marker).

Peralatan. Alat yang digunakan yaitu eppendorf‑ (1.5 ml, 0.6 ml, 0.2ml), mesin PCR, tangki elektroforesis, autoclave (MC 23DD, Japan), vacuum tainer, oven, pipet mikro, nampan, spectrofotometer (Beckman, DU650), kamera Polaroid MP4 + UV transilluminator centrifuge 5415 D (Eppendorf), Vortex‑2Genic, MUPID.

Metode

Teknik pengambilan sample

Isotasi DNA. Isolasi DNA dilakukan melalui beberapa tahap, yaitu:

  1. Sampel darah (tidak segar, diawetkan dalam alcohol ± 250 ml) ditempatkan pada 1.5 ml tabung eppendorf, kemudian ditambahkan lysis buffer dengan volume ± 500 ml dan dikocok dengan menggunakan vortex sampai sampel hancur.
  2. Sampel disentrifus dengan kecepatan 6500 rpm selama satu menit pada temperatur kamar.
  3. Supernatan dibuang, sedangkan endapannya (erytrosit dan leukosit) ditambah dengan rinse buffer dengan volume 500 ml, digoyang dengan menggunakan tangan dan divortex sebentar.
  4. Ditambahkan digestion buffer lalu digoyang dengan menggunakan tangan dan divortex sebentar.
  5. Sampel kemudian diinkubasikan semalam dengan menggunakan shaker incubator pada suhu 55°C.
  6. Setelah sampel terdigest semua, kemudian diambil dari incubator dan ditambahkan fenol sebanyak 500ml, divortex selama 30 menit sampai larutan tercampur semua.
  7. Sampel disentrifus pada kecepatan 13.000 rpm selama 2 menit.
  8. Kemudian diambil bagian atasnya (supernatant) dan dipindahkan ke tabung eppendorf baru.
  9. Ke dalam tabung eppendorf tersebut ditambahkan fenol‑chloroform dengan volume yang sama, divortex perlahan selama 30 menit.
  10. Sampel disentrifus pada 13.000 rpm selama 2 menit.
  11. Bagian atas (supernatan) diambil, lalu dimasukkan ke dalam tabung eppendorf dan ditambahkan alkohol absolut dingin 2 kali volume sample, digoyang dengan tangan selama 10 menit dan biasanya akan terbentuk material putih (pellet).
  12. Kemudian disimpan dalam freezer selama 5 menit.
  13. Sentrifus pada 13.000 rpm selama 2 menit, alkohol dibuang dan diganti dengan alkohol 70% (600ml), kemudian disentrifus sebentar pada 13.000 rpm selama 2 menit.
  14. Alkohol 70% dibuang dan material/pellet dikeringkan dengan bantuan aspirator atau vacuum.
  15. Terakhir ditambahkan larutan E (TE) sebanyak 100 ml, sentrifus sebentar dan di­inkubasikan dalam waterbath pada suhu 37°C selama 15 menit.
  16. Simpan sampel DNA dalam suhu 4°C  (simpan dalam kulkas).
  17. Sample DNA yang diperoleh diefektroforesis dengan menggunakan 1% agarose gel (1gr agarose dalam 100 ml TAE buffer) untuk mengetahui kualitasnya.
  18. Untuk mengukur konsentrasi sample DNA, digunakan alat Spektrophotometer.

Uji Kualitas dan Kuantitas (konsentrasi) DNA

Pengukuran secara kualitas, dilakukan pengecekan hasil isolasi DNA pada gel agarose, horizontal elektroforesis. Sebanvak 4 ml  DNA sampel dan 1 ml loading dye di-running dalam tangki elektroforesis agarose 1% pada 100 volt selama 30 menit. Gel hasil elektroforesis kemudian direndam dalam larutan ethidium bromide selama 10 menit. Kemudian pola pita yang dihasilkan dilihat di bawah UV transilluminator dan difoto dengan kamera Polaroid MP4. Jika muncul pita berarti DNA hasil isolasi siap untuk digunakan sebagai template untuk PCR.

Pengukuran kuantitas DNA digunakan alat spektrofotometer GeneQuant pro atau DyNA Quant. Kualitas DNA atau tingkat kemurnian DNA merupakan nilai rasio absorbansi atau optical density (OD) pada panjang  gelombang 260 nm dan 280 nm (OD260/OD280, sedangkan konsentrasi DNA diukur dengan formula: OD260 x 50 x Faktor pengenceran.

Amplifikasi DNA dengan PCR

            Pada penelitian ini ada dua lokus yang diamplifikasi yaitu lokus D‑loop dan PRE‑1. Mesin PCR yang digunakan untuk mengamplifikasi lokus D‑loop adalah Gene Amp PCR system 9600 (Perkin Elmer) dan untuk lokus PRE‑I adalah Gene Amp PCR system 2400 (perkin Elmer). Campuran reaksi untuk analisis PCR untuk kedua lokus yang diamati dapat dilihat pada Tabel 1. Runutan DNA primer yang digunakan untuk mengamplifikasi kedua lokus tersebut dapat dilihat pada Tabel 2. Program amplifikasi dilakukan sebagai berikut

Program untuk lokus D‑loop

Denaturasi 1x                          95oC selama 5 menit

Tahap siklus                1          95oC selama 30 detik 

                                    2          55oC selarna 30 detik       30 siklus

                                    3          72oC selama 60 detik

Final ekstension                      72oC selama 5 menit

Penyimpanan                           4oC sampai tak terhingga

Program untuk lokus PRE‑1

Predenaturasi  1x                    94oC selama 3 menit

Tahap siklus                1          94oC selama 1 menit

                                    2          62oC selama 0.3 menit      45 siklus

                                    3          72oC selama 1 menit

Final ekstension                      72oC selama 5 menit

Penyimpanan                           4oC sampai tak terhingga

Hasil PCR kemudian dicek pada 1% gel agarose.

Tabel 1. Campuran Reaksi untuk Analisis PCR pada Kedua Lokus

No Komponen Stock Kebutuhan Vol. yg diperlukan (ml) Lokus D-Loop Vol.yg diperlukan (ml) Lokus PRE-1
1. PCR Buffer 10x 1x 2.5 1.25
2. dNTP 0.2 0.2 mM 2.0 1.25
3, Primer 12.5 12.5 pmol 2.5 1.0 (Primer mix)
4 Primer 12.5 12.5 pmol 2.5  
5. Taq polymerase 1.25 - 0.625 (1.25 Unit/ml) 0.30 (5 Unit/ml)
6. Sampel DNA     2.0 1.0
7. Air     12.825 7.7
8. Total     25 12.5

 

Tabel 2. Sekuens Primer yang Digunakan untuk Analisis PCR

No. Lokus Sekuens promer Target Sumber
1. P2O (PRE-1) F: 5′-AggCTgACgTTgAACCTggCCAATTTATgg-3′ 381 bp Sulandari S., et al., 1997
    R: 5′-AgTgACCCCCTTATAgCCAAAgACACTTgg-3′    
2. D-loop F- 5′-AAACCAGAAAAGGAGAGCAACC-’3′    
    R- 5′-TCATCTAGGCATTTTCAGTGCC-3′    

 

Elektroforesis Gel Agarose

            Tahap visualisasi DNA ini meliputi empat tahap yaitu penyiapan gel, loading dan

elektroforesis serta pewarnaan.

  1. Penyiapan gel agarose. Konsentrasi gel agarose yang digunakana adalah 2%.
  2. Loading dan elektroforesis dilakukan sebagal berikut : susun gel dalam tangki elektroforesis, isi tangki dengan 1xTAE dan campur sampel DNA (produk PCR) dengan loading buffer (masing‑masing 4ml dan 1ml ) kemudian dimasukkan ke sumur. Masukkan penanda panjang DNA (marker) (2 ml) ke dalam salah satu sumur dan sambungkan kabel dan jalankan elektroforesis pada 100V, 30 menit.
  3. Pewarnaan dilakukan dengan mengambil gel dari pesawat elektroforesis, kemudian gel direndam di dalam larutan ethidium bromide selama ± 10 menit.
  4. Hasil pita kemudian dilihat di bawah UV transilluminator dan difoto dengan kamera Polaroid MP4. Pola pita DNA yang diperoleh kemudian dipelajari.

 

HASIL DAN PEMBAHASAN

Uji Kuantitas dan Kualitas DNA

Untuk mengetahui konsentrasi DNA pada sample digunakan mesin Spektrofotometer GeneQuant pro atau DyNAQuant. Pengukuran jumlah DNA melalui spektrofotometer didasarkan pada prinsip iradiasi sinar ultra violet (UV) yang diserap oleh nukleotida dan protein dalam larutan. Penyerapan iradiasi sinar UV secara maksimal oleh DNA dicapai pada panjang gelombang 260 nm, sedangkan penyerapan maksimal oleh protein dicapai pada panjang gelombang 280 nm.  Pada panjang gelombang 260 nm, apabila kepadatan optik (optical density, OD) atau biasa disebut OD260 sama dengan satu, maka konsentrasi molekul DNA setara dengan 50µg/ml DNA untai ganda atau 40µg/ml RNA dan DNA untai tunggal atau setara dengan 20µg/ml oligonukleotida untai tunggal (Muladno, 2002). 

Hasil pengukuran konsentrasi DNA pada sample dapat dilihat pada lampiran laporan ini. Hasil tersebut sangat bervariasi dari satu sampel ke sampel lain.  Hal ini mungkin disebabkan oleh keterbatasan penguasaan teknik dalam proses penanganan sample hingga siap untuk dianalisis menggunakan mesin spektrofotometer.   

Kemurnian DNA yang berkorelasi dengan kualitas DNA ditentukan oleh tingkat kontaminasi protein dengan cara membagi nilai kepadatan optik pada panjang gelombang 260 nm (OD260) dengan nilai kepadatan optik pada panjang gelombang 280 nm (OD280).  Jika nilai yang didapatkan berkisar antara 1.80-2.0, maka DNA dikatakan murni. Sebaliknya, jika nilai perbandingan tersebut lebih kecil dari 1.80, maka DNA tersebut terkontaminasi dengan protein (Muladno, 2002).

            Hasil yang diperoleh pada penelitian ini menunjukkan bahwa semua sample mempunyai nilai perbandingan di bawah 1.80.  Beberapa hal yang mungkin menjadi penyebabnya adalah proses pengambilan dan penyimpanan sample yang kurang baik, kesalahan teknik pengambilan supernatan sehingga terkontaminasi oleh lisis buffer serta proses digesti DNA yang mungkin tidak sempurna karena selama inkubasi, sample tersebut tidak digoyang (shaking). Akibatnya proses digesti tidak berjalan sempurna sehingga pada saat penambahan fenol, sebagian protein tidak ikut terikat dan tetap berikatan dengan DNA dalam sampel.

            Namun demikian hasil pengamatan kualitas DNA menggunakan gel elektroforesis menunjukkan adanya DNA sample yang memenuhi syarat untuk dianalisis lebih lanjut menggunakan mesin PCR. Pada Gambar 1 (A dan B) dapat dilihat dengan jelas pita DNA genom yang terdapat pada bagian atas dan pita DNA inti pada bagian bawah dengan tingkat keseragaman yang tinggi.  Hal ini menunjukkan bahwa proses ekstraksi berjalan dengan baik. 

A
B

Gambar 1.  DNA sample hasil elektroforesis 

Amplifikasi DNA dengan Mesin PCR

            Pada penelitian ini digunakan dua jenis primer, masing-masing PRE-1 yang berasal dari hewan babi dan D-Loop yang berasal dari hewan rusa. Hasil amplifikasi setiap lokus (PRE-1 dan D-Loop) pada mesin PCR selanjutnya dielektroforesis untuk memisahkan kelompok DNA yang sudah teramplifikasi. Apabila proses amplifikasi berjalan dengan baik, maka akan terlihat pita yang memisah dan sejajar untuk setiap sumur. Hasil ini selanjutnya dapat dilihat secara jelas setelah difoto menggunakan kamera polaroid. Foto hasil amplifikasi-elektroforesis untuk lokus PRE-1 dapat dilihat pada Gambar 2, sedangkan hasil amplifikasi-elektroforesis untuk lokus D-Loop dapat dilihat pada Gambar 3.

Gambar 2. Hasil amplifikasi lokus PRE-1

 

Gambar 3. Hasil amplifikasi lokus D-Loop

 

            Hasil amplifikasi lokus PRE-1 seperti yang tampak pada Gambar 2, menunjukkan bahwa lokus tersebut dapat teramplifikasi dengan baik yang ditunjukkan oleh munculnya pita yang panjang basanya seragam. Hal ini berarti pada sampel DNA yang digunakan terdapat sejumlah sekuens DNA yang berkomplemen dengan primer PRE-1.  Demikian demikian enzim polimerase dapat bekerja dengan baik untuk mensintesis molekul DNA baru dari dNTP. Muladno (2002) mengatakan bahwa dalam rangkaian proses PCR, setelah primer menempel pada posisi masing-masing, enzim polimerase mulai mensintesis molekul DNA baru yang dimulai dari ujung 3’ masing-masing primer. Selain itu ketepatan pengaturan suhu pada saat menjalankan mesin PCR, baik suhu denaturasi, anealing (penempelan) maupun suhu ekstensi menjadi kunci keberhasilan proses amplifikasi. Blake (1995) mengatakan bahwa dalam proses denaturasi ikatan non-kovalen yang mempertahankan struktur double helix DNA akan terputus.  Hal ini dapat dilakukan dengan memaparkan DNA pada temperatur tinggi, pH ekstrim, konsentrasi counter ion rendah dan beberapa pelarut yang dapat menimbulkan denaturtasi. Selanjutnya Muladno (2002) mengatakan bahwa suhu denaturasi dan ekstensi bersifat permanen, masing-masing 95oC dan 72oC, sedangkan suhu penempelan bergantung pada panjang pendeknya primer.

Hasil amplifikasi pada lokus D-Loop (Gambar 3) memperlihatkan pita dengan panjang basa yang tidak seragam. Hal ini mungkin disebabkan oleh kurang tepatnya penggunaan suhu anealing, sehingga proses penempelan primer menjadi tidak sempurna.  Selain itu primer yang digunakan berasal dari hewan rusa yang mungkin tidak sesuai dengan sekuens DNA targetnya.

KESIMPULAN

Berdasarkan hasil dan pembahasan dapat disimpulkan bahwa  sampel darah babi rusa yang digunakan pada penelitian ini dapat diamplifikasi dengan baik oleh primer PRE-1 yang berasal dari babi, sehingga dapat dikatakan bahwa secara molekuler babi rusa sama dengan babi pada umumnya.

 

DAFTAR PUSTAKA

Anonimous, 2002. Babirusa (Babyrousa babyrussa). http://www.geocities.com/The Tropics/Paradise/5301/Pg000010.htm.  

Blake, R.D.  1993. Denaturation of DNA. In Molecular Biology and Biotechnology. Robert A. Meyers (Ed.). 1993. pp 207. VCH Publishers, Inc., USA-Germany-UK.

Muladno. 2002.  Teknologi Rekayasa Genetika. Pustaka Wirausaha Muda-USESE Foundation, Bogor.

Sulandari, S., Muladno, T. Harumi, S. Yanai, Y. Wada and H. Yasui.  1997.  Localization of swine PRE-1 homologues in 13 loci of Phacochoerus aethipicus and Tayassu tajacu genomes, and their sequence divergence.  Animal Genetics 28: 210-215.

Wolfe, S.L.  1993.  Molecular and Cellular Biology. Wadsworth Publishing Company, Belmont, California.

 

Efektivitas Albumen Sebagai Media Pemisah Spermatozoa Sapi

February 3, 2010

Efektivitas Albumen Sebagai Media Pemisah Spermatozoa Sapi Pembawa Kromosom X dan Y

(Effectivity of Albumen as Separation Medium of  X  and  Y Chromosomes Bearing Bovine Spermatozoa)

Takdir Saili1,  Mozes R. Toelihere2,  Arief Boediono3  dan  Baharuddin Tappa4

1Program Studi Produksi Ternak Fakultas Pertanian Universitas Haluoleo, Kendari

2Jurusan Reproduksi dan Kebidanan Ternak FKH-IPB, Bogor

3Laboratorium Embriologi FKH-IPB, Bogor

4Laboratorium Genetika dan Reproduksi Ternak Puslitbang Biotek-LIPI, Cibinong

            Two combinations of discontinuous albumen medium were applied as separation medium to evaluate whether albumen medium is effective to change the natural ratio of X and Y chromosomes bearing bovine spermatozoa.  The first combination consisted of 10% and 30% albumen, whereas the second combination consisted of 10% and 50% albumen, respectively for top and bottom layer of column medium.  Washed semen was adjusted to a concentration of 150 x 106/ml and 1 ml of the washed semen was then layered on the top of the medium.  After an hour of separation, each level of semen was washed using centrifugation method and separated spermatozoa was finally evaluated.  Morphometric method and fluoroscopic observation were conducted to prove if the natural ratio of X and Y chromosomes bearing bovine spermatozoa has been changed.

                Results of the experiment revealed that the parameters related to viability of separated spermatozoa was reduced but still met the requirement both of in vivo and in vitro insemination.  The discontinuous levels of albumen medium was effective in the attempt to change natural ratio of X  and  Y chromosomes bearing bovine spermatozoa.

PENDAHULUAN

            Rasio alamiah spermatozoa pembawa kromosom X dan Y umumnya sebanding.  Berbagai upaya telah dilakukan untuk mengubah rasio tersebut  dengan maksud untuk dapat mengendalikan jenis kelamin anak dari suatu kelahiran, baik pada ternak maupun manusia. Salah satu metode pemisahan spermatozoa berdasarkan perbedaan motilitas spermatozoa X dan Y yang telah dianggap cukup valid adalah metode kolom albumin (Hafez 1987).

            Keberhasilan penggunaan bovine serum albumin (BSA) dan ovalbumin sebagai media pemisahan spermatozoa diawali oleh Ericsson et al. (1973). Selanjutnya dikatakan bahwa metode pemisahan dua atau tiga tahap dengan konsentrasi yang semakin meningkat lebih efektif dari pemisahan yang dilakukan satu tahap dengan berbagai konsentrasi BSA.

            Pada penelitian ini telah dicoba penggunaan putih telur (albumen) sebagai media pemisahan spermatozoa sapi untuk menggantikan BSA. Penggunaan istilah albumen adalah untuk menyebut putih telur secara umum tanpa membedakan bagian-bagian dari putih telur tersebut termasuk ovalbumin (Regenstein 1984).

            Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui viabilitas spermatozoa sapi yang telah mengalami proses pemisahan dengan menggunakan media albumen dan menguji efektivitas media albumen dalam mengubah rasio alamiah spermatozoa sapi. Hasil penelitian ini diharapkan akan bermanfaat bagi pengembangan ilmu pengetahuan dan wawasan dalam bidang reproduksi ternak, khususnya teknologi pemisahan spermatozoa pada sapi. Selain itu, penerapan teknologi ini pada tingkat lapangan (peternak) akan membawa dampak positif terhadap upaya pengendalian jenis kelamin ternak yang pada gilirannya akan meningkatkan efisiensi reproduksi ternak.

BAHAN DAN METODE

Penyiapan Media.     Pada penelitian pendahuluan telah dicoba beberapa kombinasi konsentrasi media albumen (albumen dilarutkan dalam media Brackett-Oliphant, BO). Dari berbagai kombinasi konsentrasi tersebut, telah dipilih dua kombinasi konsentrasi yang dapat memenuhi syarat awal untuk melakukan pemisahan spermatozoa sapi. Syarat yang dimaksud adalah viabilitas dan konsentrasi spermatozoa setelah pemisahan masih memenuhi kriteria untuk tujuan inseminasi.  Kombinasi media pertama adalah albumen yang dilarutkan dalam media Brackett-Oliphant (BO) dengan konsentrasi 10% (v/v) pada lapisan atas (A30) dan 30% (v/v) lapisan bawah (B30), sedangkan kelompok media kedua adalah albumen yang dilarutkan dalam BO dengan konsentrasi 10% (v/v) pada lapisan atas (A50) dan 50% (v/v) pada lapisan bawah (B50).

Penyiapan dan Pemisahan Spermatozoa.   Semen sapi diperoleh secara teratur dari seekor sapi jantan Frisian Holland (FH). Untuk mengetahui kelayakan penggunaan semen tersebut dalam proses pemisahan, dilakukan evaluasi terlebih dahulu baik secara makroskopis maupun mikroskopis. Sampel semen yang layak, selanjutnya dicuci dengan metode sentrifugasi dan diambil 1 ml (konsentrasi 150 x 106/ml) lalu dimasukkan ke dalam tabung pemisahan dan dibiarkan selama satu jam.  Selanjutnya, setiap fraksi semen disedot dan dicuci dengan mengikuti prosedur sebelumnya dan dievaluasi untuk mengetahui perubahan konsentrasi dan viabilitasnya.

Menghitung Konsentrasi dan Persentase Motilitas Spermatozoa. Konsentrasi spermatozoa dihitung dengan menggunakan haemocytometer.  Pengamatan dilakukan di bawah mikroskop cahaya pembesaran 10 x 10 dengan menghitung jumlah spermatozoa yang berada pada lima kotak teracak di dalam kamar hitung haemocytometer. Untuk mengestimasi konsentrasi spermatozoa yang sebenarnya digunakan rumus (Garner & Hafez 1987):

KS = Sh x FM x P

Keterangan :    KS       =  konsentrasi spermatozoa

                        Sh        =  jumlah spermatozoa yang terhitung pada haemocytometer

                        FM      =  faktor multiplikasi

                        P          =  pengenceran

Untuk mengetahui persentase motilitas spermatozoa sapi digunakan mikroskop cahaya dengan pembesaran 10 x 40. Penilaian yang diberikan mulai 0% (tidak ada spermatozoa yang bergerak ke depan) sampai 100% (semua spermatozoa bergerak ke depan).

Persentase Membran Plasma Utuh (%-MPU) Spermatozoa. Sampel semen dimasukkan ke dalam larutan hipo-osmotik 0.032 M NaCl, kemudian diinkubasi selama satu jam pada suhu 37oC. Spermatozoa dengan membran plasma utuh ditandai dengan ekor yang melingkar. Evaluasi dilakukan dengan menggunakan mikroskop pembesaran 10 x 40, sedangkan jumlah minimal sampel spermatozoa yang diamati adalah 100 spermatozoa.

Pengukuran Spermatozoa secara Morfometrik.    Pengukuran spermatozoa dilakukan dengan cara membuat preparat ulas terlebih dahulu.  Selanjutnya, pengukuran panjang dan bagian terlebar kepala spermatozoa dilakukan di bawah mikroskop cahaya pembesaran 10 x 100 dengan menggunakan mikrometer.  Jumlah spermatozoa yang dihitung dari masing-masing fraksi adalah 200 spermatozoa.  Untuk mengetahui luas kepala spermatozoa digunakan rumus yang dihasilkan dari data yang diperoleh dengan menerapkan metode integral dan regresi.

LKS = {0.8988 x P x L} – 1.63

Keterangan :    LKS    =  luas kepala spermatozoa

                        0.8988 =  faktor koreksi.

                        1.63     =  nilai konstanta

                        P          =  panjang kepala spermatozoa

                        L          =  bagian terlebar kepala spermatozoa

Pengamatan Spermatozoa pada Mikroskop Fluoresens. Sampel semen dibuat dalam sediaan preparat ulas sebelum dilakukan pengamatan  di bawah mikroskop fluoresens.  Zat warna yang digunakan dalam pembuatan preparat ulas ini adalah  eosin-nigrosin.  Pengamatan dilakukan terhadap spermatozoa yang memantulkan secara penuh cahaya fluoresens dan yang memantulkan sebagian atau tidak sama sekali. Spermatozoa yang memantulkan cahaya fluoresens secara penuh diprediksi sebagai spermatozoa yang membawa kromosom X, sedangkan yang kurang atau tidak sama sekali memantulkan cahaya fluoresens diprediksi sebagai spermatozoa yang membawa kromosom Y. Jumlah spermatozoa yang dihitung  dari masing-masing sampel kurang lebih 100 spermatozoa.

Analisis Data. Data sifat makroskopis dan mikroskopis semen, sebelum dan sesudah pemisahan, masing-masing disajikan dalam bentuk rataan. Untuk mengetahui efektivitas metode pemisahan yang digunakan, masing-masing pada hasil pengukuran morfometrik dan fluoroskopik digunakan uji Chi-kuadrat (Steel & Torrie, 1991).

HASIL

Evaluasi Semen Sapi Segar. Hasil evaluasi semen sapi segar baik secara makroskopis maupun mikroskopis pada penelitian ini disajikan dalam Tabel 1.

Tabel 1. Rataan hasil evaluasi semen sapi segar secara makroskopis dan mikroskopis

Parameter Keterangan
Volume (ml/ejakulat) 6.3 ± 0.5
Warna Putih – krem
Konsistensi Agak kental – kental
pH 6.4 ± 0.2
Gerakan masa ++(+)
Konsentrasi (juta/ml) 965.5 ± 69.0
Persentase motilitas (%) 77.0 ± 4.8
Persentase membran plasma utuh (%) 83.1 ± 2.3

 

            Beberapa parameter yang ada saling terkait satu sama lain.  Misalnya, semakin kental dan volume semen dalam kisaran normal, 5-8ml/ejakulat (Toelihere, 1985), maka konsentrasi spermatozoa akan tinggi.  Demikian halnya, jika motilitas tinggi dan gerakan masa mempunyai nilai positif dua (++) atau tiga (+++), maka nilai integritas membran spermatozoa akan tinggi pula.

Evaluasi Spermatozoa setelah Pemisahan. Hasil evaluasi spermatozoa setelah dipisahkan disajikan dalam Tabel 2.  Konsentrasi spermatozoa pada awal pemisahan adalah 150 x 106/ml, namun setelah pemisahan spermatozoa tersebut terbagi dalam dua lapisan media, atas (A30 dan A50) dan bawah (B30 dan B50).  Konsentrasi spermatozoa pada lapisan bawah media lebih kecil dibanding konsentrasi pada lapisan atas.  Semakin tinggi konsentrasi albumen pada lapisan bawah media, maka semakin kecil konsentrasinya.  Demikian pula halnya dengan nilai persentase motilitas dan persentase membran plasma utuh.

Tabel 2. Rataan hasil pengukuran konsentrasi dan viabilitas spermatozoa sapi sebelum dan setelah pemisahan

Parameter S0 S1 A30 B30 A50 B50
Konsentrasi (juta/ml) 965.5± 69.0 706.0 ±47.2 86.3 ± 4.6 12.87 ± 1.1 89.8 ± 5.3 9.1 ± 0.9
%-motilitas (%) 77.0 ±  4.8 75.0 ±  5.3 64.5  ±  4.8 51.0 ±  2.1 63.0 ±  4.2 50.5  ±  1.6
%-MPU (%) 83.1 ± 2.3 80.9 ± 2.6 74.5 ± 2.9 58.9 ± 3.7 71.7 ± 2.3 58.0 ± 3.3

S0 = semen segar (kontrol);  S1= semen setelah disentrifus;  A30 = semen  fraksi atas dengan kombinasi konsentrasi albumen 10/30%; B30 = semen fraksi bawah dengan kombinasi konsentrasi albumen 10/30%; A50 = semen  fraksi atas dengan kombinasi konsentrasi albumen 10/50%;  B50 = semen fraksi bawah dengan kombinasi konsentrasi albumen 10/50%.

Evaluasi Spermatozoa secara Morfometrik. Hasil evaluasi spermatozoa secara morfometrik disajikan pada Tabel 3.  Spermatozoa dengan ukuran kepala lebih kecil dari rata-rata ukuran kepala spermatozoa pada masing-masing kontrol, digolongkan spermatozoa yang membawa kromosom Y, sedangkan yang lebih besar digolongkan spermatozoa yang membawa kromosom X.  Hasil pengukuran kepala spermatozoa menunjukkan bahwa spermatozoa pada B50 mempunyai nilai rataan luas kepala yang terkecil (36.8± 4.3 mm2).  Hal ini berarti spermatozoa pada B50 didominasi oleh spermatozoa yang membawa kromosom Y.

Tabel 3. Rataan hasil pengukuran kepala spermatozoa sapi dengan menggunakan mikrometer

Parameter Jumlah spermatozoa Rata-rata ± SD (mm) Persentase spermatozoa (%)
Panjang kepala Lebar kepala Luas   kepala(mm2) X Y
S0 200 9.6 ± 0.4 4.7 ± 0.3 39.3 ± 3.6 50.5 49.5
S0-30 150 9.5 ± 0.4 4.8 ± 0.3 39.6 ± 3.6 51.3 48.7
A30 200 9.8 ± 0.3 4.9 ± 0.2 41.1 ± 2.9 73.0 ** 27.0 **
B30 200 9.3 ± 0.4 4.6 ± 0.4 37.2 ± 4.4 28.5 ** 71.5 **
S0-50 150 9.5 ± 0.4 4.8 ± 0.3 39.8 ± 3.5 50.7 49.3
A50 200 9.7 ± 0.4 4.9 ± 0.2 41.0 ± 2.8 71.5 ** 29.0 **
B50 200 9.4 ± 0.4 4.5 ± 0.4 36.8 ± 4.3 26.5 ** 73.5 **

S0 = semen segar (kontrol); S0-30 = semen kontrol untuk kombinasi konsentrasi albumen 10/30%; S0-50= semen kontrol untuk kombinasi konsentrasi albumen 10/50%;  A30 = semen  fraksi atas dengan kombinasi konsentrasi albumen 10/30%;  B30 = semen fraksi bawah dengan kombinasi konsentrasi albumen 10/30%; A50 = semen  fraksi atas dengan kombinasi konsentrasi albumen 10/50%;  B50 = semen fraksi bawah dengan kombinasi konsentrasi albumen 10/50%;  **        = berbeda sangat nyata berdasarkan uji chi-kuadrat.

Evaluasi Spermatozoa dengan Mikroskop Fluoresens. Hasil yang diperoleh pada pengamatan sinar fluoresens ini sejalan dengan hasil evaluasi spermatozoa secara morfometrik dengan nilai persentase spermatozoa Y tertinggi 72.64% diperoleh pada B50.  Data hasil pengamatan disajikan pada Tabel 4.

Tabel 4. Rataan persentase jumlah spermatozoa yang diamati dengan mikroskop fluoresens

Pengamatan Fraksi semen yang diamati
S0 A30 B30 A50 B50
X Y X Y X Y X Y X Y
1 50 55 60 24 20 58 62 26 20 52
2 57 54 62 22 26 54 64 26 18 48
3 56 55 58 26 22 56 56 24 20 54
Jumlah (%) 163/ 49.8a 164/ 50.2a 180/ 71.4b 72/ 28.6c 68/ 28.8c 168/ 71.2b 182/ 70.5b 76/  29.5c 58/  27.4c 154/ 72.6b

Huruf yang berbeda dalam baris yang sama menunjukkan perbedaan yang nyata (P < 0.01) berdasarkan uji Chi-kuadrat.

PEMBAHASAN

Evaluasi Semen Sapi Segar.  Berdasarkan hasil evaluasi terhadap semen sapi segar dapat dikatakan bahwa kuantiatas dan kualitas semen sapi yang digunakan pada penelitian ini adalah baik karena masih berada pada kisaran kualitas semen sapi yang normal seperti yang dilaporkan oleh Toelihere (1985) dan Hafez (1987), sehingga tidak ada keraguan untuk menggunakannya dalam proses pemisahan spermatozoa. Kuantitas dan kualitas semen yang baik dari sapi pejantan yang digunakan pada penelitian ini didukung oleh beberapa faktor, antara lain : kuantitas dan kualitas makanan yang baik, umur dan bobot tubuh serta sanitasi kandang yang baik.

Evaluasi Spermatozoa setelah Pemisahan.  Konsentrasi spermatozoa pada saat pemisahan adalah 150 x 106/ml.  Setelah proses pemisahan spermatozoa akan terpisah ke dalam dua fraksi yang berbeda (atas dan bawah).  Konsentrasi spermatozoa mengalami penurunan setelah proses pemisahan seperti yang ditunjukkan oleh data pada Tabel 2.  Penurunan ini diduga terjadi pada saat proses pencucian, dimana spermatozoa yang telah terikat ke dalam medium akan ikut tercuci.

Penurunan nilai persentase membran plasma utuh diduga terjadi bertahap, yaitu pada proses sentrifugasi dan pada proses pemisahan. Kerusakan membran plasma spermatozoa pada proses sentrifugasi mungkin lebih disebabkan oleh faktor fisik, sedangkan kerusakan membran plasma spermatozoa pada proses pemisahan lebih disebabkan  oleh  faktor  kimiawi.  Dow & Bavister (1989) melaporkan  bahwa  serum albumin mempunyai peranan yang penting dalam proses penghilangan kolesterol dan ion zinkum yang berfungsi menstabilkan membran plasma spermatozoa.  Hal ini disebabkan karena protein tersebut mempunyai kemampuan yang kuat untuk mengikat kolesterol dan ion zinkum.  Albumen yang terdapat pada media pemisahan dengan konsentrasi yang berbeda pada setiap fraksi diduga memainkan peranan yang sama dengan serum albumin.  Tingkat kerusakan membran plasma yang lebih kecil  pada fraksi atas dibanding fraksi bawah dapat mendukung pernyataan tersebut, karena konsentrasi albumen pada bagian atas lebih kecil dibanding bagian bawah.

Penurunan nilai persentase motilitas ini karena spermatozoa telah mengalami serangkaian perlakuan mulai proses pencucian hingga proses pemisahan yang membutuhkan banyak energi untuk tetap menormalkan kondisi fisiologinya.  Proses pencucian yang berakibat pada pengurangan konsentrasi plasma semen dan menggantinya dengan media BO mungkin merupakan salah satu faktor yang menyebabkan menurunnya nilai motilitas spermatozoa, bila dihubungkan dengan ketersediaan sumber energi  bagi spermatozoa, walaupun di dalam media BO itu sendiri terdapat glukosa.  Harrison et al. (1978) melaporkan bahwa motilitas spermatozoa akan menurun jika plasma semennya diganti dengan media utama yang mengandung 20 mM N-2-hydroxyethylpiperazine- N’-2-ethanesulphonic acid, 10 mM-glukosa, 2 mM-Na2HPO4, 4 mM-MgCl2, 2.5 mM-KOH, 100 mg/ml kanamycin sulphate dan dikondisikan pada pH 7.50 sampai 7.55 dengan NaOH.  Selain itu kerusakan membran plasma akan berpengaruh langsung terhadap ketersediaan sumber energi bagi pergerakan spermatozoa.

Evaluasi Spermatozoa secara Morfometrik.  Hasil uji Chi-kuadrat menyimpulkan bahwa baik media dengan kombinasi konsentrasi albumen 10% dan 30% maupun media dengan kombinasi konsentrasi albumen 10% dan 50%, mampu mengubah rasio alamiah (kontrol) spermatozoa sapi secara nyata. Fraksi semen dengan konsentrasi  spermatozoa Y yang tertinggi terdapat pada B50 dengan nilai 73.50%. Hal ini dimungkinkan karena tingginya konsentrasi albumen yang terdapat pada B50 menyebabkan hanya spermatozoa yang mempunyai motilitas tinggi saja yang mampu menembusnya.  Goodall & Roberts (1976) melaporkan bahwa spermatozoa Y lebih motil dibanding spermatozoa X. Selain itu, hasil penelitian Ke-hui cui & Matthews (1993) menyimpulkan bahwa spermatozoa X lebih besar dibanding spermatozoa Y. Dengan adanya perbedaan ini, maka dapat diperkirakan bahwa berat dan kecepatan geraknya juga akan berbeda.

Evaluasi Spermatozoa dengan Mikroskop Fluoresens. Pengamatan dengan mikroskop fluoresens menunjukkan adanya perbedaan intensitas cahaya yang dipantulkan di antara   spermatozoa dalam suatu pengamatan.  Spermatozoa yang dapat memantulkan cahaya fluoresens dengan baik diprediksi sebagai spermatozoa X, sedang yang tidak memantulkan dengan baik diprediksi sebagai spermatozoa Y. Hal ini dimungkinkan karena luas kepala spermatozoa X lebih besar dibanding Y (Ke-hui cui & Matthews 1993; Ericsson & Glass, 1982) yang berkorelasi positif dengan massa DNA (Kaneko et al. 1983; Sumner & Robinson 1976). Potensi ini diduga akan menyebabkan perbedaan tingkat penyerapan zat warna yang pada gilirannya akan memantulkan sinar fluoresens dengan intensitas yang berbeda.

            Berdasarkan hasil penelitian ini dapat disimpulkan bahwa media albumen cukup efektif penggunaannya sebagai media separasi dan spermatozoa hasil pemisahan masih memenuhi kriteria sebagai sumber gamet jantan untuk tujuan inseminasi, baik secara in vivo maupun in vitro.

DAFTAR PUSTAKA

Dow, M.P.D. & B.D. Bavister.  1989.  Direct contact is required between serum albumin and hamster spermatozoa for capacitation in vitro.  Gamete Research. 23: 171-180.

Ericsson, R.J. & R.H. Glass.  1982.  Functional differences between sperm bearing the X and Y chromosomes, hlm. 201-211. Di dalam R.P. Amann & G.E. Seidel, Jr. (ed.).  Prospects for Sexing Mammalian Sperm.  Colorado Associated University Press, Boulder, Colorado-USA.

Ericsson, R.J., C.N. Langevin & M. Nishino. 1973.  Isolation of fraction rich in human Y sperm.  Nature. 246: 421-424.

Garner, D.L. & E.S.E. Hafez.  1987.  Spermatozoa and seminal plasma, hlm. 189-209. Di dalam: Hafez, E.S.E. (ed.), Reproduction in Farm Animals.  Lea and Febiger, Philadelphia.

Goodall, H. & A.M. Roberts. 1976.  Difference in motility of human X and Y bearing spermatozoa.  J. Reprod. Fert.  48: 433-436.

Hafez, E.S.E.  1987.  Reproduction in Farm Animals.  Ed. ke-5.  Lea and Febiger, Philadelphia.

Harrison, R.A.P., H.M. Dott  &  G.C. Foster.  1978.  Effect of ionic strength, serum albumin and other macromolecules on the maintenance of motility and the surface of mammalian  spermatozoa in a simple medium.  J. Reprod. Fert.  52: 65-73.

Kaneko, S., J. Yamaguchi,  T. Kobayashi & R. Iizuka.  1983.  Separation of human X and Y bearing sperm using percoll density gradient centrifugation.  Fertil. Steril. 40: 661-665.

Ke-hui, C.  &  C.D. Matthews.  1993.  X larger than Y.  Nature. 366: 117-118.

Regenstein, J.M.  1984.  Food Protein Chemistry.  Academic Press, Inc., London.

Steel, R.G.D. & J.H. Torrie.  1991.  Prinsip dan Prosedur Statistika.  Gramedia, Jakarta.

Sumner, A.T. & J.A. Robinson.  1976.  A differences in dry mass between the heads of X and Y chromosome bearing human spermatozoa.  J. Reprod. Fert. 48: 9-15.

Toelihere, M.R.  1985.  Inseminasi Buatan pada Ternak.  Angkasa, Bandung.

Hello world!

February 2, 2010

Welcome to WordPress.com. This is your first post. Edit or delete it and start blogging!


Follow

Get every new post delivered to your Inbox.